蛋白質(zhì)測(cè)定的方法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)(常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法)

1.常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是測(cè)定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無(wú)機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來(lái)并為過(guò)量的硼酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，就可計(jì)算出樣品中的氮量。

由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計(jì)算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。

優(yōu)點(diǎn)：可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單；實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較低；結(jié)果準(zhǔn)確，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；用改進(jìn)方法（微量凱氏定氮法）可測(cè)定樣品中微量的蛋白質(zhì)。

缺點(diǎn)：凱氏定氮法只是一個(gè)氧化還原反應(yīng)，把低價(jià)氮氧化并轉(zhuǎn)為氨鹽來(lái)測(cè)定，而不能把高價(jià)氮還原為氮鹽的形式，所以不可以測(cè)出物質(zhì)中所有價(jià)態(tài)的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個(gè)用于鑒定蛋白質(zhì)的分析方法。雙縮脲試劑是一個(gè)堿性的含銅試液，呈藍(lán)色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。

當(dāng)?shù)孜镏泻须逆I時(shí)（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過(guò)比色法分析濃度，在紫外可見(jiàn)光譜中的波長(zhǎng)為540nm。鑒定反應(yīng)的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應(yīng)蛋白質(zhì)單位1-10mg。

優(yōu)點(diǎn)：測(cè)定速度較快，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近。

缺點(diǎn)：①靈敏度差；?②?三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會(huì)干擾該反應(yīng)。

3、酚試劑法

取6支試管分別標(biāo)號(hào)，前5支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，最后一支試管加待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于650nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，對(duì)水溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定很有效。

缺點(diǎn)：①費(fèi)時(shí)，要精確控制操作時(shí)間；②酚法試劑的配制比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測(cè)定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。

取9支試管分別標(biāo)號(hào)，前8支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，1號(hào)試管不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，最后一支試管加待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，而不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補(bǔ)足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，記錄吸光度值。

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后能回收。?

缺點(diǎn)：①測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，專一性差；?②干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。

5、考馬斯亮藍(lán)法

考馬斯亮藍(lán)顯色法的基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)可與考馬斯亮藍(lán)G-250 定量結(jié)合。當(dāng)考馬斯亮藍(lán) G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其對(duì)可見(jiàn)光的最大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。

在考馬斯亮藍(lán) G-250 過(guò)量且濃度恒定的情況下，當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度不同時(shí)，就會(huì)有不同量的考馬斯亮藍(lán) G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉(zhuǎn)變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉(zhuǎn)變有一定的數(shù)量關(guān)系。

一般情況，當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加時(shí)，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍(lán) G-250 顯色法來(lái)測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響，適合大量樣品的測(cè)定。

缺點(diǎn)：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。

參考資料來(lái)源：百度百科-蛋白質(zhì)測(cè)定

2.通常蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法有哪些,比較優(yōu)缺點(diǎn)

定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。

考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。 凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費(fèi)時(shí) 8~10小時(shí) 將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng) 雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò)合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似 紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶； Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸； 各種硫醇 耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強(qiáng)堿性緩沖液； SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。

3.各種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)定量測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)

一、凱氏（kjeldahl）定氮法

優(yōu)點(diǎn)： 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少優(yōu)點(diǎn)

①可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；

②操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單；

③實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較低；

④結(jié)果準(zhǔn)確，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；

⑤用改進(jìn)方法（微量凱氏定氮法）可測(cè)定樣品中微量的蛋白質(zhì)

缺點(diǎn)

①最終測(cè)定的是總有機(jī)氮，而不只是蛋白質(zhì)氮；

②實(shí)驗(yàn)時(shí)間太長(zhǎng)（至少需要2h才能完成）；

③精度差，精度低于雙縮脲法；

④所用試劑有腐蝕性.

靈敏度低 適用于0.2-1.0mg氮 干擾物質(zhì) ：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） ；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)

二 Folin-酚試劑法

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測(cè)得，是測(cè)定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。

缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。

對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。

此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。

三、Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：

(1)靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。

(2)測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。

(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。

此法的缺點(diǎn)是：

(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。

四 紫外吸收法

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4）2so4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。

缺點(diǎn)：測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。

五、雙縮脲法（Biuret法）

優(yōu)點(diǎn)：較快速，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)顯色相似

缺點(diǎn)：不太靈敏

4.測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么

Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗(yàn)原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡?白質(zhì)溶液測(cè)定的方法。

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白 質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。

這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。

在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1?g。

這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。

完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的 過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。

因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。

如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測(cè)定法。

5.各種蛋白互作檢測(cè)方法有哪些優(yōu)缺點(diǎn)

雙雜交技術(shù) 原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報(bào)告基因。 缺點(diǎn)：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會(huì)造成假陽(yáng)性。融合蛋白會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。不利于核外蛋白研究，會(huì)導(dǎo)致假隱性。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 指兩個(gè)熒光法色基團(tuán)在足夠近（<100埃）時(shí)，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對(duì)某些刺激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測(cè)，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測(cè)大分子的構(gòu)象變化，能夠定性定量的檢測(cè)相互作用的強(qiáng)度。 缺點(diǎn) 此項(xiàng)技術(shù)要求發(fā)色基團(tuán)的距離小于100埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標(biāo)記。 生化標(biāo)記技術(shù)文檔，生化標(biāo)記技術(shù)文檔下載，生物幫上面有介紹的。

6.標(biāo)準(zhǔn)曲線法與其他蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法比較,有何優(yōu)缺點(diǎn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線法又稱校準(zhǔn)曲線法，做法是將貯備標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為所需要的標(biāo)準(zhǔn)系列，用零濃度調(diào)儀器零點(diǎn)后，依次由低到高濃度測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度（或峰高、面積），同

時(shí)測(cè)定樣品和樣品空白的吸光度（或峰高、面積），在坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。它一般適用于已知樣品的基本成分

和標(biāo)準(zhǔn)液的基本成分相接近的樣品。

標(biāo)準(zhǔn)加入法是分別在數(shù)份相同體積樣品液中加入不等量的標(biāo)準(zhǔn)液，一定要有一份相同體積樣品液中加入

的標(biāo)準(zhǔn)液為零，按照上面繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測(cè)量吸光度（或峰高、面積），在坐標(biāo)紙上以加入的標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用

外推法（延長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和橫坐標(biāo)相交的數(shù)的絕對(duì)值）就可得到樣品液濃度。它一般適用于組份較復(fù)雜的未知樣品，能消除一些基本成份對(duì)測(cè)定的干擾，但對(duì)測(cè)定的未

知成分含量要粗略估計(jì)一下，加入的標(biāo)準(zhǔn)液要和樣品液濃度接近，

優(yōu)缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較高，但是比較麻煩，要做很多標(biāo)準(zhǔn)溶液