測(cè)蛋白質(zhì)含量都方法方法(測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法,其原理各是什么)
1.測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗(yàn)原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡?白質(zhì)溶液測(cè)定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白 質(zhì)測(cè)定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1?g。
這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。
完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的 過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測(cè)定法。
2.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定都有哪幾種方法,適用情況以及優(yōu)缺點(diǎn)
①凱氏定氮法 原理：蛋白質(zhì)平均含氮量為16%。
當(dāng)樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉(zhuǎn)化為銨鹽，在強(qiáng)堿性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最后用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定硼酸，通過標(biāo)準(zhǔn)酸的用量即可求出蛋白質(zhì)中的含氮量和蛋白質(zhì)含量。 ②雙縮脲法 原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在堿性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。
蛋白質(zhì)中的肽鍵實(shí)際上就是酰胺鍵，故多肽、蛋白質(zhì)等都有雙縮脲（biuret）反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色或紫色復(fù)合物。比色定蛋白質(zhì)含量。
缺點(diǎn)：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 （數(shù)mg），且會(huì)受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 準(zhǔn)確度 較高，不受蛋白質(zhì)的種類影響。
③Folin酚法（Lowry） Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑（堿性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+, Cu+能定量地與Folin-酚試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，600nm比色測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 靈敏度較高（約 0.1 mg），但較麻煩，也會(huì)受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。
步驟中各項(xiàng)試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會(huì)有大誤差。 ④紫外法 280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進(jìn)行測(cè)定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計(jì)算： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.24E280-0.74E260 (280 260為角標(biāo)) ⑤色素結(jié)合法（Bradford 法） 直接測(cè)定法：利用蛋白質(zhì)與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結(jié)合物的光吸收用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。 考馬斯亮蘭（CBG）染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
CBG 有點(diǎn)像指示劑，會(huì)在不同的酸堿度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍(lán)色。當(dāng) CBG接到蛋白質(zhì)上去的時(shí)候，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)會(huì)提供 CBG一個(gè)較為中性的環(huán)境，因此會(huì)變成藍(lán)色。
當(dāng)樣本中的蛋白質(zhì)越多，吸到蛋白質(zhì)上的CBG也多，藍(lán)色也會(huì)增強(qiáng)。因此，藍(lán)色的呈色強(qiáng)度，是與樣本中的蛋白質(zhì)量成正比。
間接測(cè)定法：蛋白質(zhì)與某些酸性或堿性色素分子結(jié)合形成不溶性的鹽沉淀。用分光光度計(jì)測(cè)定未結(jié)合的色素，以每克樣品結(jié)合色素的量來(lái)表示蛋白質(zhì)含量的多少。
⑥BCA法 BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4'-二羧-2,2'-二喹啉)法與Lowry法相似，主要差別在堿性溶液中，蛋白質(zhì)使Cu2+轉(zhuǎn)變Cu+后，進(jìn)一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結(jié)合產(chǎn)生深紫色，在波長(zhǎng)562 nm有強(qiáng)的吸收。 它的優(yōu)點(diǎn)在于堿性溶液中BCA 比Folin試劑穩(wěn)定，因此BCA與堿性銅離子溶液結(jié)合的呈色反應(yīng)只需一步驟即完成。
靈敏度Lowry法相似。 本方法對(duì)于陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會(huì)受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測(cè)定法 膠體金（colloidal gold）是氯金酸（chloroauric acid）的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，并能與多種生物大分子結(jié)合。 膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色的改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。
⑧其他方法 有些蛋白質(zhì)含有特殊的 非蛋白質(zhì)基團(tuán)，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團(tuán)，可測(cè) 403 nm 波長(zhǎng)的吸光來(lái)定量之。 含特殊金屬的酶 （如鎘），則可追蹤該金屬。
3.蛋白質(zhì)含量測(cè)定的基本方法有哪些
pro的測(cè)定方法分為兩大類：一類是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測(cè)定pro含量，另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定pro含量。
但是食品種類很多，食品中pro含量又不同，特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此pro的測(cè)定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收，用標(biāo)準(zhǔn)酸或堿液滴定，由樣品中含氮量計(jì)算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。
4.蛋白質(zhì)定量測(cè)定的方法有哪些
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。
凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費(fèi)時(shí)
8~10小時(shí) 將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)
雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò)合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似
紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；
Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；
各種硫醇 耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強(qiáng)堿性緩沖液；
SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
