常用蛋白質(zhì)的提取方法優(yōu)缺點(diǎn)(常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法)

1.常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是測(cè)定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無(wú)機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來(lái)并為過(guò)量的硼酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，就可計(jì)算出樣品中的氮量。

由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計(jì)算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。

優(yōu)點(diǎn)：可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單；實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較低；結(jié)果準(zhǔn)確，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；用改進(jìn)方法（微量凱氏定氮法）可測(cè)定樣品中微量的蛋白質(zhì)。

缺點(diǎn)：凱氏定氮法只是一個(gè)氧化還原反應(yīng)，把低價(jià)氮氧化并轉(zhuǎn)為氨鹽來(lái)測(cè)定，而不能把高價(jià)氮還原為氮鹽的形式，所以不可以測(cè)出物質(zhì)中所有價(jià)態(tài)的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個(gè)用于鑒定蛋白質(zhì)的分析方法。雙縮脲試劑是一個(gè)堿性的含銅試液，呈藍(lán)色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。

當(dāng)?shù)孜镏泻须逆I時(shí)（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色?？赏ㄟ^(guò)比色法分析濃度，在紫外可見(jiàn)光譜中的波長(zhǎng)為540nm。鑒定反應(yīng)的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應(yīng)蛋白質(zhì)單位1-10mg。

優(yōu)點(diǎn)：測(cè)定速度較快，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近。

缺點(diǎn)：①靈敏度差；?②?三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會(huì)干擾該反應(yīng)。

3、酚試劑法

取6支試管分別標(biāo)號(hào)，前5支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，最后一支試管加待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于650nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，對(duì)水溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定很有效。

缺點(diǎn)：①費(fèi)時(shí)，要精確控制操作時(shí)間；②酚法試劑的配制比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測(cè)定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。

取9支試管分別標(biāo)號(hào)，前8支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，1號(hào)試管不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，最后一支試管加待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，而不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補(bǔ)足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，記錄吸光度值。

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后能回收。?

缺點(diǎn)：①測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，專一性差；?②干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。

5、考馬斯亮藍(lán)法

考馬斯亮藍(lán)顯色法的基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)可與考馬斯亮藍(lán)G-250 定量結(jié)合。當(dāng)考馬斯亮藍(lán) G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其對(duì)可見(jiàn)光的最大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。

在考馬斯亮藍(lán) G-250 過(guò)量且濃度恒定的情況下，當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度不同時(shí)，就會(huì)有不同量的考馬斯亮藍(lán) G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉(zhuǎn)變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉(zhuǎn)變有一定的數(shù)量關(guān)系。

一般情況，當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加時(shí)，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍(lán) G-250 顯色法來(lái)測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響，適合大量樣品的測(cè)定。

缺點(diǎn)：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。

參考資料來(lái)源：百度百科-蛋白質(zhì)測(cè)定

2.通常蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法有哪些,比較優(yōu)缺點(diǎn)

定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。

考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。 凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費(fèi)時(shí) 8~10小時(shí) 將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng) 雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò)合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似 紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶； Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸； 各種硫醇 耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強(qiáng)堿性緩沖液； SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。

3.各種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)定量測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)

一、凱氏（kjeldahl）定氮法

優(yōu)點(diǎn)： 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少優(yōu)點(diǎn)

①可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；

②操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單；

③實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較低；

④結(jié)果準(zhǔn)確，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；

⑤用改進(jìn)方法（微量凱氏定氮法）可測(cè)定樣品中微量的蛋白質(zhì)

缺點(diǎn)

①最終測(cè)定的是總有機(jī)氮，而不只是蛋白質(zhì)氮；

②實(shí)驗(yàn)時(shí)間太長(zhǎng)（至少需要2h才能完成）；

③精度差，精度低于雙縮脲法；

④所用試劑有腐蝕性.

靈敏度低 適用于0.2-1.0mg氮 干擾物質(zhì) ：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） ；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)

二 Folin-酚試劑法

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測(cè)得，是測(cè)定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。

缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。

對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。

此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。

三、Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：

(1)靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。

(2)測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。

(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。

此法的缺點(diǎn)是：

(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。

四 紫外吸收法

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4）2so4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。

缺點(diǎn)：測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。

五、雙縮脲法（Biuret法）

優(yōu)點(diǎn)：較快速，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)顯色相似

缺點(diǎn)：不太靈敏

4.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定都有哪幾種方法,適用情況以及優(yōu)缺點(diǎn)

①凱氏定氮法 原理：蛋白質(zhì)平均含氮量為16%。

當(dāng)樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉(zhuǎn)化為銨鹽，在強(qiáng)堿性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最后用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定硼酸，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酸的用量即可求出蛋白質(zhì)中的含氮量和蛋白質(zhì)含量。 ②雙縮脲法 原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在堿性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。

蛋白質(zhì)中的肽鍵實(shí)際上就是酰胺鍵，故多肽、蛋白質(zhì)等都有雙縮脲（biuret）反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色或紫色復(fù)合物。比色定蛋白質(zhì)含量。

缺點(diǎn)：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 （數(shù)mg），且會(huì)受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 準(zhǔn)確度 較高，不受蛋白質(zhì)的種類影響。

③Folin酚法（Lowry） Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑（堿性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。

在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+, Cu+能定量地與Folin-酚試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，600nm比色測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 靈敏度較高（約 0.1 mg），但較麻煩，也會(huì)受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。

步驟中各項(xiàng)試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會(huì)有大誤差。 ④紫外法 280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進(jìn)行測(cè)定。

280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計(jì)算： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.24E280-0.74E260 (280 260為角標(biāo)) ⑤色素結(jié)合法（Bradford 法） 直接測(cè)定法：利用蛋白質(zhì)與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結(jié)合物的光吸收用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。 考馬斯亮蘭（CBG）染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

CBG 有點(diǎn)像指示劑，會(huì)在不同的酸堿度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍(lán)色。當(dāng) CBG接到蛋白質(zhì)上去的時(shí)候，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)會(huì)提供 CBG一個(gè)較為中性的環(huán)境，因此會(huì)變成藍(lán)色。

當(dāng)樣本中的蛋白質(zhì)越多，吸到蛋白質(zhì)上的CBG也多，藍(lán)色也會(huì)增強(qiáng)。因此，藍(lán)色的呈色強(qiáng)度，是與樣本中的蛋白質(zhì)量成正比。

間接測(cè)定法：蛋白質(zhì)與某些酸性或堿性色素分子結(jié)合形成不溶性的鹽沉淀。用分光光度計(jì)測(cè)定未結(jié)合的色素，以每克樣品結(jié)合色素的量來(lái)表示蛋白質(zhì)含量的多少。

⑥BCA法 BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4'-二羧-2,2'-二喹啉)法與Lowry法相似，主要差別在堿性溶液中，蛋白質(zhì)使Cu2+轉(zhuǎn)變Cu+后，進(jìn)一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結(jié)合產(chǎn)生深紫色，在波長(zhǎng)562 nm有強(qiáng)的吸收。 它的優(yōu)點(diǎn)在于堿性溶液中BCA 比Folin試劑穩(wěn)定，因此BCA與堿性銅離子溶液結(jié)合的呈色反應(yīng)只需一步驟即完成。

靈敏度Lowry法相似。 本方法對(duì)于陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會(huì)受還原糖 及EDTA的干擾。

⑦膠體金測(cè)定法 膠體金（colloidal gold）是氯金酸（chloroauric acid）的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，并能與多種生物大分子結(jié)合。 膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色的改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

⑧其他方法 有些蛋白質(zhì)含有特殊的 非蛋白質(zhì)基團(tuán)，如 過(guò)氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團(tuán)，可測(cè) 403 nm 波長(zhǎng)的吸光來(lái)定量之。 含特殊金屬的酶 （如鎘），則可追蹤該金屬。

5.蛋白質(zhì)分離方法有哪些,它們的特點(diǎn)各是什么

1.根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化 蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì)，并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，因此可以利用一些較簡(jiǎn)單的方法使蛋白 質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離.根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過(guò)濾等.透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時(shí)常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液進(jìn)行分離.超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過(guò)程.這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無(wú)機(jī)鹽為主的小分子分開(kāi).它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無(wú)機(jī)鹽.由于超濾過(guò)程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，以致超濾速度減慢，截流物質(zhì)的分子量也越來(lái)越小.所以在使用超濾方法時(shí)要選擇合適的濾膜，也可以選擇切向流過(guò)濾得到更理想的效果 離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時(shí)可以利用離心的方法將它們分開(kāi).例如，在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，加入纖維素酶和α-淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后，再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離[3].使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度（區(qū)帶）離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據(jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白，得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低.蔣辰等[6]通過(guò)比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果，利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過(guò)濾也稱凝膠滲透層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一.凝膠過(guò)濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動(dòng)并最先流出柱外；反之，比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外.目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過(guò)程中使用凝膠過(guò)濾方法可以得到很好的效果，純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)（88∶12）、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過(guò)濾在抗凝血蛋白的提取過(guò)程中也被用來(lái)除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7]. 2.根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等.但在同一條件下，不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度，根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件，就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的.常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等. 等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法.每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn)，而且在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最 低；相反，有些蛋白質(zhì)在一定pH值時(shí)很容易溶解.因而可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)分離純化蛋白質(zhì).王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過(guò)程發(fā)現(xiàn)，pH值為時(shí)茶葉蛋白提取效果最好，提取率達(dá)到36·8%，初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時(shí)將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4，使目標(biāo)蛋白于等電點(diǎn)沉淀出來(lái).等電點(diǎn)沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取.李鳳英等[10]測(cè)得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為3·8.他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì)，得到了最佳的提取工藝為：以1*10-5mol·L-1的NaOH溶液，按1∶5的料液比，在40℃攪拌40 min，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達(dá)73·78%.另外還可以利用堿法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚(yú)魚(yú)肉蛋白質(zhì)無(wú)腥味、色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)90%[12]. 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象，其中，增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶，反之為鹽析.應(yīng)當(dāng)指出，同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽，如MgCl2、（NH4）2SO4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度影響的效果，要比一價(jià)離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來(lái)提取蛋白質(zhì)，其最佳提取工藝是：以10%NaCl溶液，按1∶25的料液比，在30℃攪拌提取30min，蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法，其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn).由于硫酸銨在水中呈酸性，為防止其對(duì)蛋白質(zhì)的破壞，應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性.為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后，通常要使用透析或者凝膠過(guò)濾的方法除去中性鹽[13]. 有機(jī)溶劑提取法的原理是：與水互溶的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇）能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此，控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì).例如，在冰浴中磁力攪拌下，在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢。