文庫構(gòu)建方法(cDNA文庫的構(gòu)建方法)
1.cDNA 文庫的構(gòu)建有哪些方法
cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
經(jīng)典 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的 cDNA 加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取（例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機(jī)溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定），要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的 cDNA 文庫，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時(shí)必須仔細(xì)小心。
由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個(gè)無 RNA 酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉(zhuǎn)錄酶 Oligo(dT) 引導(dǎo)下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成（用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時(shí)包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進(jìn)行的修復(fù)反應(yīng)），合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴(kuò)增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進(jìn)行鑒定。
這里強(qiáng)調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是 λ 噬菌體，這是因?yàn)?λ DNA 兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。
2.基因文庫構(gòu)建的過程、原理及方法
1 cDNA 文庫的構(gòu)建 1.1 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理與方法 cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
經(jīng)典 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的 cDNA 加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提?。ɡ绠惲蚯杷犭曳?，鹽酸胍—有機(jī)溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定），要構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的 cDNA 文庫，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時(shí)必須仔細(xì)小心。
由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個(gè)無 RNA 酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉(zhuǎn)錄酶 Oligo(dT) 引導(dǎo)下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成（用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時(shí)包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進(jìn)行的修復(fù)反應(yīng)），合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴(kuò)增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進(jìn)行鑒定。
這里強(qiáng)調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是 λ 噬菌體，這是因?yàn)?λ DNA 兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全長文庫 經(jīng)典 cDNA 文庫的構(gòu)建雖然高效、簡便，但文庫克隆的片段一般較小，單個(gè)克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個(gè)克隆才能覆蓋一個(gè)完整的全基因的 cDNA。
為了克隆到真正的 cDNA 全長，建立富含全長的 cDNA 文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉(zhuǎn)錄酶作用特點(diǎn)所導(dǎo)致的局限性。
全長 cDNA 文庫，是指從生物體內(nèi)一套完整的 mRNA 分子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個(gè)完整的拷貝。全長 cDNA 文庫不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過基因序列比對得到 mRNA 剪接信息，此外，還可以對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測及進(jìn)行體外表達(dá)和通過反向遺傳學(xué)研究基因的功能等。
目前所報(bào)道的對全長文庫的構(gòu)建一般按照美國 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 （Invitrogen,USA） 使用說明進(jìn)行。判斷一個(gè) cDNA 文庫中的 cDNA 序列是否是全長基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。
1.2.1 直接從序列上評價(jià) 5'端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物已知的對應(yīng)基因5'末端進(jìn)行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個(gè) ATG 上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，一般加在5'帽結(jié)構(gòu)后有一段富含嘧啶的區(qū)域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經(jīng)過酶切保護(hù)的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。
3'端：同樣可以用其它生物已知的對應(yīng)基因3'末端進(jìn)行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個(gè)以上的 PolyA 加尾信號，或無明顯加尾信號的則也有 PolyA 尾。 1.2.2 用實(shí)驗(yàn)方法證實(shí) 可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長度，如：5'端 RACE,3'端 RACE，或者通過 Northern Blot 證實(shí)大小是否一致。
1.3 對 cDNA 文庫的分析 對 cDNA 文庫質(zhì)量的評價(jià)主要有兩個(gè)方面。第一方面為文庫的代表性，cDNA 文庫的代表性是指文庫中包含的重組 cDNA 分子反映來源細(xì)胞中表達(dá)信息（即 mRNA 種類）的完整性，它是體現(xiàn)文庫質(zhì)量的最重要指標(biāo)。
文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來衡量，它是指構(gòu)建的原始 cDNA 文庫中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)。庫容量取決于來源細(xì)胞中表達(dá)出的 mRNA 種類和每種 mRNA 序列的拷貝數(shù)，1個(gè)正常細(xì)胞含10000~30000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細(xì)胞總計(jì)數(shù)群中所占比例少于0.5%時(shí)。
滿足最低要求的 cDNA 文庫的庫容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計(jì)算（ P 為文庫中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設(shè)為99%;N 為文庫中以 P 概率出現(xiàn)細(xì)胞中任何一種 mRNA 序列理論上應(yīng)具有的最少重組子克隆數(shù)；n 為細(xì)胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數(shù)；T 為細(xì)胞中表達(dá)出的所有 mRNA 的總拷貝數(shù)）。第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。
在細(xì)胞中表達(dá)出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區(qū)，中間的編碼區(qū)和3'端非翻譯區(qū)。
非翻譯區(qū)的序列特征對基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用，編碼序列則是合成基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)模板。因此，要從文庫中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組 cDNA 片段足夠長以便盡可能地反應(yīng)出天然基因的結(jié)構(gòu)。
2 cDNA 文庫構(gòu)建的其它類型 2.1 均一化 cDNA 文庫 它是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中，且在 cDNA 文庫中表達(dá)基因?qū)?yīng)的 cDNA 的拷貝數(shù)相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫進(jìn)行。
3.如何建立自己的文庫
文庫不需要建立，你注冊了百度帳號，就有自己的文庫了。
登錄百度知道后，在頁面上方點(diǎn)“文庫”，再在右上角點(diǎn)“個(gè)人文庫”，然后點(diǎn)“我的貢獻(xiàn)”，就進(jìn)入你的文庫了。
在你的文庫里，可以看到你的文庫積分，以及你上傳或下載的文檔。
現(xiàn)在百度文檔可以復(fù)制，也可以免費(fèi)收藏了。
復(fù)制方法：
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找到文檔后，打開文檔，在文檔的下面有“收藏此文檔”和“下載”兩個(gè)按扭
你點(diǎn)“收藏此文檔”，就可以把文檔收藏到你的文庫里了。
下載方法：
如果你文庫財(cái)富值足夠，去百度文庫搜索你想要的文檔直接下載就行了。
如果沒有文庫財(cái)富值，可以在知道里提問，求助其他網(wǎng)友幫你下載。
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上傳文檔很難通過的，最好獲得文庫財(cái)富值的方法是第二種！
4.百度文庫如何建立
百度文庫“文檔專輯”功能 點(diǎn)擊創(chuàng)建文輯，填標(biāo)題、介紹、分類，關(guān)鍵詞方便用戶在使用時(shí)候更快更好地找到自己想看和喜歡看的文檔。
“文檔專輯”功能中，二級和二級以上用戶可以把文檔按照某個(gè)主題集合成一個(gè)專輯，也就是創(chuàng)建文輯。您可以收藏一個(gè)文輯，并給文輯打分，其他的文友們也可以通過用戶創(chuàng)建的文輯受益，與此同時(shí)用戶可以通過文輯獲得財(cái)富值獎(jiǎng)勵(lì)！（具體的財(cái)富值獎(jiǎng)勵(lì)策略見百度文庫的幫助頁。）
創(chuàng)建文檔專輯 用戶在進(jìn)入文庫首頁的某個(gè)分類后會看到分類下有文檔和文輯兩個(gè)選項(xiàng)卡，點(diǎn)擊文輯的選項(xiàng)卡后，會看到右上角有一個(gè)創(chuàng)建文輯的按鈕。 點(diǎn)擊創(chuàng)建文輯后，填寫文輯的標(biāo)題、介紹、分類，然后為你的文輯填寫幾個(gè)關(guān)鍵詞（非必填項(xiàng)）。
文輯標(biāo)題最好是能概括文輯中的文檔內(nèi)容，字?jǐn)?shù)太少或太沒有明確的意義的話可能不利于文輯發(fā)揮作用。文輯的介紹是對這個(gè)文輯的一段介紹性的語句，方便讓其他的用戶更了解此文輯要傳達(dá)的意思。
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在文輯的詳細(xì)頁面也可以創(chuàng)建文輯，還可以查看相關(guān)文輯推薦。 當(dāng)然咯，在自己的個(gè)人中心也可以創(chuàng)建文輯，也可以查看自己創(chuàng)建的文輯，是不是很方便呢。
5.百度文庫怎么建立
百度文庫“文檔專輯”功能
點(diǎn)擊創(chuàng)建文輯，填標(biāo)題、介紹、分類，關(guān)鍵詞
方便用戶在使用時(shí)候更快更好地找到自己想看和喜歡看的文檔。“文檔專輯”功能中，二級和二級以上用戶可以把文檔按照某個(gè)主題集合成一個(gè)專輯，也就是創(chuàng)建文輯。您可以收藏一個(gè)文輯，并給文輯打分，其他的文友們也可以通過用戶創(chuàng)建的文輯受益，與此同時(shí)用戶可以通過文輯獲得財(cái)富值獎(jiǎng)勵(lì)！（具體的財(cái)富值獎(jiǎng)勵(lì)策略見百度文庫的幫助頁。） 創(chuàng)建文檔專輯 用戶在進(jìn)入文庫首頁的某個(gè)分類后會看到分類下有文檔和文輯兩個(gè)選項(xiàng)卡，點(diǎn)擊文輯的選項(xiàng)卡后，會看到右上角有一個(gè)創(chuàng)建文輯的按鈕。 點(diǎn)擊創(chuàng)建文輯后，填寫文輯的標(biāo)題、介紹、分類，然后為你的文輯填寫幾個(gè)關(guān)鍵詞（非必填項(xiàng)）。 文輯標(biāo)題最好是能概括文輯中的文檔內(nèi)容，字?jǐn)?shù)太少或太沒有明確的意義的話可能不利于文輯發(fā)揮作用。文輯的介紹是對這個(gè)文輯的一段介紹性的語句，方便讓其他的用戶更了解此文輯要傳達(dá)的意思。文輯的分類和文檔的分類是一致的，你需要選擇一個(gè)符合文輯的分類方便大家找到針對性的文輯哦！ 添加文檔 您可以在這些輸入框中輸入你想收集到此文輯中的文檔的鏈接：在文庫找到一篇你喜歡的文檔，然后復(fù)制下它的鏈接到這些輸入框即可。 選擇合適的文檔后復(fù)制此文檔的鏈接。 添加的文檔鏈接在3個(gè)以上才可以成功提交哦！超過5個(gè)可以點(diǎn)擊繼續(xù)添加。 提交文輯 提交成功后可以繼續(xù)創(chuàng)建文輯或者查看創(chuàng)建的文輯。 文輯創(chuàng)建者可以在文輯中添加文檔，添加過程和創(chuàng)建過程的添加文檔方式一樣。用戶可以為你的文輯打分，如果很喜歡你創(chuàng)建的文輯也可以收藏，文輯被收藏創(chuàng)建者可是有財(cái)富值獎(jiǎng)勵(lì)的哦！為你打分的用戶也可以得到財(cái)富值獎(jiǎng)勵(lì)。在文輯的詳細(xì)頁面也可以創(chuàng)建文輯，還可以查看相關(guān)文輯推薦。 當(dāng)然咯，在自己的個(gè)人中心也可以創(chuàng)建文輯，也可以查看自己創(chuàng)建的文輯，是不是很方便呢！
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