真菌性污染的檢測方法(微生物室常用的病原真菌檢查方法)

1.微生物室常用的病原真菌檢查方法有哪些

您好！

1、真菌鏡檢

是最簡(jiǎn)單也是很有價(jià)值的實(shí)驗室診斷方法。其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便、快速，無(wú)菌部位的陽(yáng)性結果可直接確定真菌感染。但是由于陽(yáng)性率較低，陰性結果亦不能排除診斷。直 接鏡檢對于淺表和皮下真菌感染最有幫助。在皮膚刮屑、毛發(fā)或甲標本中發(fā)現皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌的成分可提供對相應真菌病的可靠診斷。如在無(wú)菌體液的 直接鏡檢中發(fā)現真菌成分常可確立深部真菌病的診斷，例如在腦脊液中檢測到帶莢膜的新生隱球菌酵母細胞，或外周血涂片中檢測到莢膜組織胞漿菌細胞。但一般在 有菌部位則只有發(fā)現大量真菌菌絲方才有意義，通過(guò)直接鏡檢一般可以區分念珠菌、隱球菌、暗色真菌、毛霉（接合菌）等菌的感染，進(jìn)一步明確鑒定菌種需要通過(guò) 培養鑒定來(lái)完成。

2、真菌培養

真菌培養是實(shí)驗室檢查中的重要環(huán)節，培養出致病真菌是進(jìn)一步鑒定菌種的前提條件。真菌培養第一步是從臨床標本中培養真菌的初代培養，初代培養后進(jìn)一步進(jìn)行 分離純化培養和鑒定培養。不同致病真菌每一步所采用的培養基，培養時(shí)間和培養溫度存在一定的差異。常規的真菌培養需要在28-30°C溫度下培養3-4 周，一般初代培養選用沙氏培養基（SDA）或者馬鈴薯瓊脂培養基（PDA），采用試管培養，一般同時(shí)培養兩管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或慶大霉素均 可）。在培養1周內，應該每天觀(guān)察有無(wú)真菌生長(cháng)。一般培養4周后，如果無(wú)真菌生長(cháng)可報陰性。發(fā)現培養出真菌，直接挑取少量菌體或者小培養后，用乳酸酚棉蘭 制成涂片顯微鏡下觀(guān)察，結合菌落大體形態(tài)，典型菌種可直接報告種屬。不典型菌種根據基本表現，采用適當的標準鑒定培養基，標準培養條件培養，必要時(shí)要結合 生理學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

3、真菌鑒定

對常見(jiàn)致病真菌要掌握的鑒定原則是首先區分酵母菌和霉菌。

如果初代培養基上培養出酵母樣菌落，在鑒定前應進(jìn)行分離純化。在去除細菌和其他真菌污染，區分混合感染后，對純菌落進(jìn)行鑒定。酵母菌鑒定主要根據形態(tài)學(xué)特 征和生理生化特點(diǎn)，按照一定的流程進(jìn)行。首先根據菌落顏色進(jìn)行分類(lèi)。臨床最為常見(jiàn)的是白色或奶白色菌落，這類(lèi)菌進(jìn)一步做芽管試驗，若芽管試驗是陽(yáng)性則為白 念珠菌，若陰性則通過(guò)Vitek YBC或API20C及玉米吐溫瓊脂上培養的形態(tài)特征來(lái)鑒定。另外，還可以應用念珠菌顯色瓊脂、尿素酶試驗等試驗來(lái)輔助鑒定。

檢驗地帶網(wǎng)

霉菌的鑒定非常復雜，有許多標準包括形態(tài)學(xué)特征、溫度耐受性，放線(xiàn)菌酮抗性、雙相性、營(yíng)養需求、蛋白分解活動(dòng)以及水解尿素能力等。現代分類(lèi)學(xué)鑒定方法主要 依據分生孢子的個(gè)體發(fā)生過(guò)程結合其他特征來(lái)進(jìn)行鑒定。初代培養后根據形態(tài)學(xué)特征一般可鑒定到屬的水平，再依據不同真菌的鑒定要求，采用標準培養基和培養條 件進(jìn)一步完成菌種鑒定。例如：曲霉屬鑒定時(shí)需要采用標準培養基，即察氏培養基和麥芽瓊脂，25℃培養7天后與曲霉形態(tài)鑒定檢索表對應得到正確的結果。

2.怎樣檢測環(huán)境中的細菌和真菌

1、選取五套培養皿進(jìn)行實(shí)驗，一個(gè)做為對比，另外四個(gè)用來(lái)培養不同環(huán)境中的細菌，并且是在不同的環(huán)境中培養，以便得出細菌和真菌的生存條件。

2、培養皿經(jīng)過(guò)高溫滅菌，準備至少5套培養皿。因為對比不同環(huán)境中的細菌與真菌的存在情況，是屬于單因素比較，所以除了采樣地點(diǎn)是變量外，進(jìn)行微生物培養的條件等也要保持一致

3、經(jīng)過(guò)高溫處理后可以將培養皿上、培養基內混有的細菌或真菌的孢子等殺死（經(jīng)過(guò)嚴格的高溫滅菌的環(huán)境中是不可能有細菌和真菌存在的），這樣就排除了實(shí)驗外其他環(huán)境的污染。因此，在實(shí)驗前不要盲目的打開(kāi)培養皿，以防止細菌或真菌的孢子等落在培養基上，實(shí)驗中用無(wú)菌棉棒的目的同樣是為了防止棉棒上的微生物污染培養基。

4、在不同的環(huán)境中細菌的分布是不相同的，因此在采集菌種的時(shí)候要注意選擇環(huán)境，做到要有一定的代表性。

5、接種好的培養基要放在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行培養。

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3.曲霉菌感染檢測方法有哪些

GM抗原的檢測目前最主流的方法是經(jīng)典的一步法酶聯(lián)免疫試驗，目前國內外廣泛認可的檢測產(chǎn)品是由美國B(niǎo)io-Rad公司提供的曲霉菌抗原檢測試劑盒（），可快速、靈敏的發(fā)現血液循環(huán)中的GM抗原，幫助臨床實(shí)現早期發(fā)現曲霉菌感染。

GM抗原是曲霉菌半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原的簡(jiǎn)稱(chēng)，是曲霉菌胞壁的組成成分，在菌絲生長(cháng)過(guò)程中可釋放人血液，檢測患者血清中GM抗原水平有助于侵襲性曲霉菌病（Invasive Aspergillosis, IA）的早期診斷。推薦首次檢測時(shí)間點(diǎn)一般為當臨床懷疑患者發(fā)生IA時(shí)，或者需要對免疫妥協(xié)患者進(jìn)行常規篩查時(shí)。1另外，對于開(kāi)始進(jìn)行抗真菌治療的患者，推薦進(jìn)行每周兩次的GM水平監測，以幫助判斷臨床療效及患者預后。2

由于血清學(xué)試驗為間接檢測手段，除外檢測試劑盒的選擇，感染曲霉菌類(lèi)型、宿主本身、以及使用的診斷標準和方法等，都可能影響檢測結果。所以在檢測過(guò)程中，需要注意各種影響的因素，以盡可能獲得準確的結果，避免出現假陽(yáng)性或假陰性而干擾了最終的臨床診斷，延誤患者診治。在不考慮檢測者本身操作原因及試驗環(huán)境污染等因素的前提下，我們來(lái)了解下哪些因素可能會(huì )影響試驗結果：3

生物學(xué)因素：

· 感染部位（比如鼻竇，肺部，還是播散性）

· 感染部位的微環(huán)境（比如營(yíng)養，氧含量，PH值）

· 曲霉菌種類(lèi)

· 是否使用抗真菌藥物

· 釋放的GM抗原分子結構

· 患者免疫抑制的程度

· 腎臟清除率，肝代謝情況

· 患者體內是否存在GM抗體

· 樣本的保存條件及時(shí)間

· 患者檢測前的治療情況

流行病學(xué)因素：

· 患者所屬人群

· 當地感染流行率

· 樣本采集手段

· Cut-off值的設定

· 感染患者的界定標準

· 實(shí)驗室檢測經(jīng)驗

由于對結果的影響因素眾多，為了確保最終結果的準確性，選擇高質(zhì)量的檢測試劑盒就顯得至關(guān)重要，即便選擇了值得信賴(lài)的檢測產(chǎn)品，操作者在分析GM抗原檢測結果時(shí)，還是需要結合各種客觀(guān)的影響因素，為臨床提供最為準確可性的報告。

4.病原微生物中細菌常見(jiàn)檢測方法有哪些

細菌 [what]什么是細菌？細菌（英文：germs;bacteria）隸屬生物學(xué)一類(lèi)，是在自然界分布最廣、個(gè)體數量最多的有機體，是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。

細菌主要由細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、核質(zhì)體等部分構成，有的細菌還有夾膜、鞭毛、菌毛等特殊結構。絕大多數細菌的直徑大小在0.5~5μm之間。

可根據形狀分為三類(lèi)，即：球菌、桿菌和螺旋菌（包括弧形菌）。 還有一種利用細菌的生活方式來(lái)分類(lèi)，即可分為兩大類(lèi)：腐生生活與寄生生活。

（一）細胞壁 細胞壁厚度因細菌不同而異，一般為15-30nm。主要成分是肽聚糖，由n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸構成雙糖單元，以β（1-4）糖苷鍵連接成大分子。

n-乙酰胞壁酸分子上有四肽側鏈，相鄰聚糖纖維之間的短肽通過(guò)肽橋（革蘭氏陽(yáng)性菌）或肽鍵（革蘭氏陰性菌）橋接起來(lái)，形成了肽聚糖片層，像膠合板一樣，粘合成多層。 肽聚糖中的多糖鏈在各物種中都一樣，而橫向短肽鏈卻有種間差異。

革蘭氏陽(yáng)性菌細胞壁厚約20~80nm，有15-50層肽聚糖片層，每層厚1nm，含20-40%的磷壁酸（teichoic acid），有的還具有少量蛋白質(zhì)。革蘭氏陰性菌細胞壁厚約10nm，僅2-3層肽聚糖，其他成分較為復雜，由外向內依次為脂多糖、細菌外膜和脂蛋白。

此外，外膜與細胞之間還有間隙。 肽聚糖是革蘭陽(yáng)性菌細胞壁的主要成分，凡能破壞肽聚糖結構或抑制其合成的物質(zhì)，都有抑菌或殺菌作用。

如溶菌酶是n-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制轉肽酶的活性，抑制肽橋形成。 細菌細胞壁的功能包括：保持細胞外形；抑制機械和滲透損傷（革蘭氏陽(yáng)性菌的細胞壁能耐受20kg/cm2的壓力）；介導細胞間相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；協(xié)助細胞運動(dòng)和分裂。

脫壁的細胞稱(chēng)為細菌原生質(zhì)體（bacterial protoplast）或球狀體（spheroplast，因脫壁不完全），脫壁后的細菌原生質(zhì)體，生存和活動(dòng)能力大大降低。 （二）細胞膜 是典型的單位膜結構，厚約8~10nm，外側緊貼細胞壁，某些革蘭氏陰性菌還具有細胞外膜。

通常不形成內膜系統，除核糖體外，沒(méi)有其它類(lèi)似真核細胞的細胞器，呼吸和光合作用的電子傳遞鏈位于細胞膜上。某些行光合作用的原核生物（藍細菌和紫細菌），質(zhì)膜內褶形成結合有色素的內膜，與捕光反應有關(guān)。

某些革蘭氏陽(yáng)性細菌質(zhì)膜內褶形成小管狀結構，稱(chēng)為中膜體（mesosome）或間體（圖3-11），中膜體擴大了細胞膜的表面積，提高了代謝效率，有擬線(xiàn)粒體（chondroid）之稱(chēng)，此外還可能與dna的復制有關(guān)。 （三）細胞質(zhì)與核質(zhì)體 細菌和其它原核生物一樣，沒(méi)有核膜，dna集中在細胞質(zhì)中的低電子密度區，稱(chēng)核區或核質(zhì)體（nuclear body）。

細菌一般具有1-4個(gè)核質(zhì)體，多的可達20余個(gè)。核質(zhì)體是環(huán)狀的雙鏈dna分子，所含的遺傳信息量可編碼2000~3000種蛋白質(zhì)，空間構建十分精簡(jiǎn)，沒(méi)有內含子。

由于沒(méi)有核膜，因此dna的復制、rna的轉錄與蛋白的質(zhì)合成可同時(shí)進(jìn)行，而不像真核細胞那樣這些生化反應在時(shí)間和空間上是嚴格分隔開(kāi)來(lái)的。 每個(gè)細菌細胞約含5000~50000個(gè)核糖體，部分附著(zhù)在細胞膜內側，大部分游離于細胞質(zhì)中。

細菌核糖體的沉降系數為70s，由大亞單位（50s）與小亞單位（30s）組成，大亞單位含有23srrna,5srrna與30多種蛋白質(zhì)，小亞單位含有16srrna與20多種蛋白質(zhì)。30s的小亞單位對四環(huán)素與鏈霉素很敏感，50s的大亞單位對紅霉素與氯霉素很敏感。

細菌核區dna以外的，可進(jìn)行自主復制的遺傳因子，稱(chēng)為質(zhì)粒（plasmid）。質(zhì)粒是裸露的環(huán)狀雙鏈dna分子，所含遺傳信息量為2~200個(gè)基因，能進(jìn)行自我復制，有時(shí)能整合到核dna中去。

質(zhì)粒dna在遺傳工程研究中很重要，常用作基因重組與基因轉移的載體。 胞質(zhì)顆粒是細胞質(zhì)中的顆粒，起暫時(shí)貯存營(yíng)養物質(zhì)的作用，包括多糖、脂類(lèi)、多磷酸鹽等。

（四）其他結構 許多細菌的最外表還覆蓋著(zhù)一層多糖類(lèi)物質(zhì)，邊界明顯的稱(chēng)為莢膜（capsule），如肺炎球菌，邊界不明顯的稱(chēng)為粘液層（slime layer），如葡萄球菌。莢膜對細菌的生存具有重要意義，細菌不僅可利用莢膜抵御不良環(huán)境；保護自身不受白細胞吞噬；而且能有選擇地粘附到特定細胞的表面上，表現出對靶細胞的專(zhuān)一攻擊能力。

例如，傷寒沙門(mén)桿菌能專(zhuān)一性地侵犯腸道淋巴組織。細菌莢膜的纖絲還能把細菌分泌的消化酶貯存起來(lái)，以備攻擊靶細胞之用。

鞭毛是某些細菌的運動(dòng)器官，由一種稱(chēng)為鞭毛蛋白（flagellin）的彈性蛋白構成，結構上不同于真核生物的鞭毛。細菌可以通過(guò)調整鞭毛旋轉的方向（順和逆時(shí)針）來(lái)改變運動(dòng)狀態(tài)。

菌毛是菌體表面極其的蛋白纖細，須用電鏡觀(guān)察。特點(diǎn)是：細、短、直、硬、多，菌毛與細菌運動(dòng)無(wú)關(guān)，根據形態(tài)、結構和功能，可分為普通菌毛和性菌毛兩類(lèi)。

前者與細菌吸附和侵染宿主有關(guān)，后者為中空管子，與傳遞遺傳物質(zhì)有關(guān)。 （五）繁殖 細菌一二分裂的方式繁殖，某些細菌處于不利的環(huán)境，或耗盡營(yíng)養時(shí)，形成內生孢子，又稱(chēng)芽孢，是對不良環(huán)境有強抵抗力的休眠體，由于芽胞在細菌細胞內形成，故常稱(chēng)為內生孢子。

芽孢的生命力非常頑強，有些湖底沉積土中的芽抱桿茵經(jīng)500-1000年后仍有活力，肉毒梭菌的芽孢在ph 7.0時(shí)能耐受100℃煮沸5-9.5小。