高效液相色譜法定量的方法(高效液相色譜有幾種定量方法,其中哪種是比較精確的定量方法)
1.高效液相色譜有幾種定量方法,其中哪種是比較精確的定量方法
峰面積法、峰高法、歸一法、外標(biāo)法。峰面積法是比較精確的定量方法
簡(jiǎn)介：
高效液相色譜法（\HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。它是在生化和分析化學(xué)中常用的柱層析儀。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法有效方便快捷地解決化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中得出想要的數(shù)據(jù)，成為重要的分離分析技術(shù)。
2.高效液相色譜有幾種定量方法
峰面積法、峰高法、歸一法、外標(biāo)法。
峰面積法是比較精確的定量方法簡(jiǎn)介：高效液相色譜法（\HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。它是在生化和分析化學(xué)中常用的柱層析儀。
高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法有效方便快捷地解決化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中得出想要的數(shù)據(jù)，成為重要的分離分析技術(shù)。
3.HPLC法中定量分析方法大致有哪幾種
高效液相色譜以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，是以高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過程。
通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于100um 的吸附劑（ 硅膠、氧化鋁等）。
這種傳統(tǒng)的液相色譜所用的固定相粒度大，傳質(zhì)擴(kuò)散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進(jìn)行簡(jiǎn)單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度?。?um-10um）、傳質(zhì)快、柱效高。
高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的一種分析方法。近年來，在保健食品功效成分、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測(cè)定等應(yīng)用廣泛。
世界上約有80%的有機(jī)化合物可以用HPLC來分析測(cè)定。 類型： 吸附色譜 在吸附色譜中，樣品的極性官能團(tuán)牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非極性烴基幾乎不予保留。
所以，要清楚地辨別極性功能團(tuán)的種類、數(shù)量和位置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應(yīng)是能溶解于有機(jī)溶劑并是非離子型的，強(qiáng)離子樣品是不適宜的。
吸附色譜所使用的流動(dòng)相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎(chǔ)，按照樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃度為10%或更少一些。如有可能，可進(jìn)一步減小百分?jǐn)?shù)。
因?yàn)楦邼舛鹊拇紩?huì)減少填料的吸附活性，減弱吸附能力，并使重現(xiàn)困難。 分配色譜 1.正相分配色譜 正相分配色譜適用于不溶于水而溶于有機(jī)溶劑且?guī)в袠O性基團(tuán)的樣品，但正相分配色譜不適合于離子型物質(zhì)。
2.反相分配色譜 這種方法應(yīng)用非常廣泛，應(yīng)用的范圍也很廣，在反相分配色譜中，樣品的非極性部分起保留作用。 通過使用的流動(dòng)相是水—甲醇和水—乙腈，通過加入甲醇或乙腈的量的不同來調(diào)節(jié)分離，但如果樣品帶有離子型基團(tuán)，需要在流動(dòng)相中加入鹽或調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH值，例如，如果樣品有一個(gè)—COOH 基團(tuán)，使流動(dòng)相的PH值是偏向酸性的，由于抑制了—COOH基團(tuán)的電離而加強(qiáng)了保留。
這個(gè)方法叫離子抑止法，如果樣品有強(qiáng)離子基，有時(shí)候采用在流動(dòng)相中加入適當(dāng)抗衡離子以形成離子對(duì)的離子對(duì)法。 在調(diào)節(jié)PH值中，保持PH值在填料說明書手冊(cè)中所規(guī)定的范圍內(nèi)，大多數(shù)化學(xué)鍵式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，當(dāng)加入鹽以后，最好使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能應(yīng)用非常廣泛的PH值。
離子交換色譜 這個(gè)方法是用填料的固定相的離子交換基團(tuán)和樣品的離子基團(tuán)之間的離子交換來分離樣品組分的，按照所交換的離子分成陽(yáng)離子交換和陰離子交換。 離子交換色譜使用于能溶于水的離子型物質(zhì)。
在離子交換色譜中，流動(dòng)相的鹽的濃度、PH及鹽的種類等都對(duì)保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。
因?yàn)槁然飼?huì)腐蝕不銹鋼儀器，在高效液相色譜中不能使用NaCl或其他的氯化物鹽類。根據(jù)測(cè)量波長(zhǎng)有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在210nm，當(dāng)檢測(cè)處在短波端的時(shí)候，用醋酸作流動(dòng)相是不合適的。
凝膠色譜 凝膠色譜不同于以上三種分離方法。凝膠色譜是根據(jù)分子大小用分子篩效應(yīng)來分離樣品組分的。
這個(gè)方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經(jīng)常用作填料。
因?yàn)樵跇悠分校〕叽绲姆肿由钌畹貪B透到微孔中，所以遲流出，而大尺寸的分子沒有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，叫做凝膠滲透色譜。
凝膠色譜依樣品的性質(zhì)又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。 1.凝膠滲透色譜 凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography），簡(jiǎn)稱GPC。
此一類的色譜，使用于有機(jī)性溶媒的樣品中，如PVC,PS,ABS等等，而所用的洗脫液有THF,Chloroform等等。 2.凝膠過濾色譜 凝膠過濾色譜（Gel Filtrarion Chromatography），簡(jiǎn)稱GFC。
此一種類的層析法，使用于水溶媒的試劑中，如蛋白質(zhì)、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩沖液等等。 凝膠的種類很多，按其原料來源可分為有機(jī)膠和無(wú)機(jī)膠。
按其制備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據(jù)凝膠的強(qiáng)度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。
根據(jù)它對(duì)溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。
4.高效液相色譜有哪些定量分析方法
1.外標(biāo)法，是以對(duì)照品的量對(duì)比求算試樣含量的方法。
只要待測(cè)組分出峰、無(wú)干擾、保留時(shí)間適宜即可用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。 2.內(nèi)標(biāo)法，是以待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法。
使用內(nèi)標(biāo)法可以抵消儀器穩(wěn)定性差、進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確等原因帶來的定量分析誤差。內(nèi)標(biāo)法可以分為校正曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法（內(nèi)標(biāo)對(duì)比法）、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法及校正因子法。
3.內(nèi)加法，是將待測(cè)組分I的對(duì)照品加至待測(cè)試樣溶液中，測(cè)定增加對(duì)照品后的溶液比原試樣溶液中I組分的峰面積增量，求算I組分的含量。
5.有哪些常用的色譜定量方法
色譜定量方法比較2006年12月20日
星期三
15:31定量分析常用術(shù)語(yǔ)：
樣品（sample）含有帶測(cè)物，供色譜分析的溶液。分為標(biāo)樣和未知樣。
標(biāo)樣（standard）濃度已知的純品。
未知樣（unknow）濃度待測(cè)的混合物。
樣品量（sample
weight）待測(cè)樣品的原始稱樣量。
稀釋度（dilution）未知樣的稀釋倍數(shù)。
組分（componance）欲做定量分析的色譜峰，即含量未知的被測(cè)物。
組分的量（amount）被測(cè)物質(zhì)的含量（或濃度）。
積分（integerity）由計(jì)算機(jī)對(duì)色譜峰進(jìn)行的峰面積測(cè)量的計(jì)算過程。
校正曲線（calibration
curve）組分含量對(duì)響應(yīng)值的線性曲線，由已知量的標(biāo)準(zhǔn)物建立，用于測(cè)定待測(cè)物的未知含量。
常用的定量方法
標(biāo)準(zhǔn)曲線法，分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。
外標(biāo)法在液相色譜中用的最多。
內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確但是麻煩，在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多。
外標(biāo)法
用被測(cè)化合物的純品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制成一系列的已知濃度的標(biāo)樣。
注入色譜柱的到其響應(yīng)值（峰面積）。
在一定范圍內(nèi)，標(biāo)樣的濃度與響應(yīng)值之間存在較好的線性關(guān)系，即W=f*A，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下，注入未知樣品，得到欲測(cè)組分的響應(yīng)值。
根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測(cè)組分的濃度
外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：
操作、計(jì)算簡(jiǎn)單，是一種常用的定量方法。
無(wú)需各組分都被檢出、洗脫。
需要標(biāo)樣。
標(biāo)樣及未知樣品的測(cè)定條件要一致。
進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確。
外標(biāo)法缺點(diǎn)：
實(shí)驗(yàn)條件要求高，如檢測(cè)器的靈敏度，流速、流動(dòng)相組成的不能發(fā)生變化；每次進(jìn)樣體積要有好的重復(fù)性。
內(nèi)標(biāo)法
操作：
將已知量的內(nèi)標(biāo)樣加入標(biāo)準(zhǔn)樣品，制成混合標(biāo)樣，并配制一系列的已知濃度的工作標(biāo)樣?；旌蠘?biāo)樣中標(biāo)樣與內(nèi)標(biāo)樣的摩爾比不變。
注入色譜柱，以（標(biāo)樣峰面積/內(nèi)標(biāo)樣峰面積）為響應(yīng)值。
根據(jù)響應(yīng)值與工作標(biāo)樣濃度之間存在的線性關(guān)系，即W=f*A，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將已知量的內(nèi)標(biāo)樣加入未知樣品，注入色譜柱，得到欲測(cè)組分的響應(yīng)值。
根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測(cè)組分的濃度
內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)：
操作過程中樣品和內(nèi)標(biāo)是混合在一起注入色譜柱的，因此只要混合溶液中被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)的量的比值恒定，上樣體積的變化不會(huì)影響影響定量結(jié)果。
內(nèi)標(biāo)法抵消了上樣體積，乃至流動(dòng)相、檢測(cè)器的影響，因此比外標(biāo)法精確。
