腸道菌群檢測方法(腸道致病菌的分類及常用檢測方法)
1.腸道致病菌的分類及常用檢測方法
根據(jù)可培養(yǎng)細菌的數(shù)量分類在腸道菌群中，可以培養(yǎng)到的細菌有400余種，依據(jù)其數(shù)量多少可以分為主要（優(yōu)勢）菌群（predominant microflora）和次要菌群（sub—dominant microflora）。
①主要（優(yōu)勢）菌群：指腸道菌群中數(shù)量大或種群密集度大的細菌，一般在10~10cfu/g以上，包括類桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和梭菌屬等專性厭氧菌，通常屬于原籍菌群。優(yōu)勢菌群是對宿主發(fā)揮生理功能的菌群，在很大程度上影響著整個菌群的功能，決定著菌群對宿主的生理病理意義。
②次要菌群：數(shù)量在10~10cfu/g以下，主要為需氧菌或兼性厭氧菌，如大腸桿菌和鏈球菌等，流動性大，有潛在致病性，大部分屬于外籍菌群或過路菌群。檢測方法：1、采樣及稀釋 （1）按無菌操作法將檢樣25g（或25mL）放于含有225mL無菌水的三角瓶中（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。
固體檢樣最好用無菌均質(zhì)器，以8000~10000r/min的速度離心1min，做成1:10的稀釋液。（2）用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1Ml，注入含有9mL無菌水的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1:100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀釋液。
（3）根據(jù)食品的衛(wèi)生要求或?qū)z驗樣品污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。
2、乳糖初發(fā)酵試驗 即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細菌。
將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵管。lmL及1mL以下者，用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管。
每一個稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。3、分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18~24h，然后觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色、鏡檢并作復發(fā)酵試驗。
4、乳糖復發(fā)酵試驗 即通常所說的證實試驗，其目的在于證明經(jīng)乳糖初發(fā)酵試驗呈陽性反應的試管內(nèi)分離到的革蘭陰性無芽胞桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。在上述選擇性EMB培養(yǎng)基上，挑取可疑的大腸菌群菌落1~2個進行革蘭染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±l℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時，觀察產(chǎn)氣情況。
凡乳搪發(fā)酵管產(chǎn)氣，革蘭染色為陰性反應的無芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽性；凡乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭染色為陽性，則報告為大腸菌群陰性。擴展資料：有益菌菌群的生理功能：如果腸內(nèi)有益菌菌群占優(yōu)，腸內(nèi)黏膜呈現(xiàn)粉紅色，表示腸內(nèi)環(huán)境相當良好。
1、吸收水分，糞便較軟，較易排泄 在胃部分解消化的食物，經(jīng)由小腸吸收營養(yǎng)后，成為粘稠狀物體送至大腸。然后再經(jīng)過18小時將水分及礦物質(zhì)吸收，就變成容易排泄的糞便。
腸道內(nèi)環(huán)境良好時，糞便的軟硬適中，排便會較為順利。2、緩和的蠕動，能順利將糞便排出 藉由腸的蠕動，將糞便緩慢的推送至肛門。
如果蠕動過快或太慢，都將影響糞便的構(gòu)成，導致便秘或者腹瀉。而如果腸內(nèi)干凈，則蠕動的速度就相當?shù)挠幸?guī)律，糞便可順利排出。
3、有助維他命的合成 比菲德氏菌等好菌能維護肌膚的健康，并具有合成有助熱量產(chǎn)生的維他命B1、B2及B6等，以及與止血、骨骼形成有關(guān)的維他命K等之功用。健康的腸道，好菌會不斷繁殖，維他命的合成也可順利進行。
4、迅速排出有害物質(zhì) 健康的腸道并非完全沒有壞菌的存在，有害物質(zhì)多少會產(chǎn)生。當然還包括，吃進體內(nèi)的食品化學添加物或是無法成為營養(yǎng)成分的物質(zhì)。
只要腸內(nèi)環(huán)境良好，這些物質(zhì)在開始危害身體前就被排出體外。5、避免病原菌的侵害 比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身體的免疫機能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特質(zhì)，所以像是含有好菌的乳酸飲料或健康食品等，都可抑制病原菌在腸內(nèi)繁殖。
腸道有益菌菌群除了以上功能之外，對人體還有營養(yǎng)作用，如糖尿病、高血壓、高血脂等。B族維生素和非必需氨基酸對人類的毛發(fā)具有重要的作用，當缺少這些營養(yǎng)元素，會導致頭發(fā)脫落或毛發(fā)發(fā)黃、發(fā)叉，容易折斷等現(xiàn)象。
參考資料來源：百度百科-腸道菌群。
2.大腸菌群檢測方法及說明
一、大腸菌群介紹 大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。
一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。 大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。
調(diào)查研究表明，大腸菌群細菌多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)?；顒拥膱鏊约坝屑S便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。
大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。
糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。 大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一，目前已被國內(nèi)外廣泛應用于食品衛(wèi)生工作中。
二、大腸菌群檢驗方法： 由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。
目前國內(nèi)采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制訂的行業(yè)標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。
（一）國家標準：國家標準采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。 乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。
36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。 分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。
證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。
報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。 具體操作參見GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標準 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 大腸菌群測定》 （二）原國家商檢局制訂的行業(yè)標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進行檢測。
本方法采用兩步法： 推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。
證實試驗：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。
查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。 具體操作參見 SN0169-92 《中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》 三、說明： 1.MPN檢索表： MPN 為最大可能數(shù)（Most Probable Number）的簡稱。
這種方法，對樣品進行連續(xù)系列進行稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。 MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應相應降低或增加10倍。
注意國家標準和行業(yè)標準中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結(jié)果報告單位也不相同。 2.初發(fā)酵和證實試驗： 無論是國家標準的三步法還是行業(yè)標準的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進行了兩次發(fā)酵試驗，培養(yǎng)基的配制略有不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。
初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。
因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。 3.產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時比小米粒還小），有時可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。
實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應作進一步試驗。
4.挑選菌落： 國家標準中，需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍平板分離，對典型和可疑菌落進行觀察和證實試驗。由于大腸菌群是一群細菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。
國家標準方法規(guī)定伊紅美藍平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。 另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個菌。
