流式細胞術(shù)在臨床醫學(xué)中的應用進(jìn)展(光子學(xué)在信息處理應用中的進(jìn)展)
流式細胞術(shù)在臨床醫學(xué)中的應用進(jìn)展
流式細胞術(shù)在臨床醫學(xué)中的應用進(jìn)展
流式細胞術(shù)在臨床醫學(xué)中的應用進(jìn)展【1】
【摘要】 流式細胞術(shù)(FCM)是一種對單細胞快速定量分析的新技術(shù),能夠快速分析單個(gè)細胞的多種特性，其既可以定性也可以定量，適于大量樣品的檢測。
隨著(zhù)流式細胞分析技術(shù)與方法的日臻完善和臨床應用范圍不斷拓寬，幾乎臨床醫學(xué)各學(xué)科都涉及到流式細胞分析技術(shù)的應用，已逐漸成為推動(dòng)臨床醫學(xué)發(fā)展的重要手段,本文就流式細胞術(shù)在臨床上的應用進(jìn)展作一綜述。
【關(guān)鍵詞】流式細胞術(shù);臨床;進(jìn)展
流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是20世紀70年代發(fā)展起來(lái)的對單細胞定量分析的一種新技術(shù)。
它借鑒了熒光標記技術(shù)、激光技術(shù)、單抗技術(shù)和計算機技術(shù),具有極高的檢測速度與統計精確性,而且從單一細胞可以測得多個(gè)參數,為生物醫學(xué)與臨床檢驗提供了全新視角和強有力手段[1]。
目前,隨著(zhù)單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展,流式細胞儀檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛使用在基礎研究和臨床實(shí)踐的各個(gè)方面,發(fā)揮著(zhù)重要作用。
本文就其在臨床上的應用綜述如下。
1 流式細胞術(shù)在免疫學(xué)中的應用�
FCM可以進(jìn)行淋巴細胞亞群分析,可同時(shí)檢測出一種或幾種淋巴細胞表面亞群分析,將不同的淋巴細胞亞群區分開(kāi)來(lái),并計算出它們相互間的比例。
通過(guò)對患者淋巴細胞各亞群數量的測定了解淋巴細胞的分化功能,鑒別新的淋巴細胞亞群。
更重要的是通過(guò)研究大多數疾病的特異性淋巴細胞亞群或某些細胞表面標志的存在、缺乏、過(guò)度表達等,對一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等診斷、治療、免疫功能重建和器官移植監測等有重要的臨床意義。
如HIV主要侵襲CD4+T細胞而導致CD4淋巴細胞減少,CD4/CD8淋巴細胞比值下降,為艾滋病的診斷和治療提供依據[2]。
在其它免疫功能性疾病的診治方面如系統性紅斑狼瘡(SLE)患者的淋巴細胞變化可反映該病的活動(dòng)情況和器官侵犯程度,伴有嚴重腎臟損害的SLE患者可出現低CD4+、高CD8+的現象[3]。
此外,FCM可以用來(lái)進(jìn)行組織相容性抗原(HLA)群體分析;HLA-B27抗原陽(yáng)性與強直性脊柱炎等一系列關(guān)節病有著(zhù)不同程度的正相關(guān)。
FCM應用HLA-B27特異性單抗檢測抗原，其敏感性較傳統的微量細胞毒性實(shí)驗大大提高,同時(shí)多參數的熒光測定使我們能夠在特定的細胞亞群中分析HLA-B27[4-5],還可以利用FCM進(jìn)行移植配型移植后免疫狀態(tài)監測。
2 流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應用�
血液系統腫瘤的診斷和治療 FCM通過(guò)對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對白血病、淋巴瘤等各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著(zhù)舉足輕重的作用。
FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測定一個(gè)細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。
各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態(tài)學(xué)檢查難以區別時(shí)，免疫表型參數對各種急性白血病、淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用，其診斷的準確性可達到90%左右[5]。
微小殘留病變(MRD)是白血病復發(fā)的主要根源,FCM能在患者緩解期檢測是否有殘留病變細胞，及早發(fā)現后采取措施避免復發(fā)。
而且測定 DNA倍體和進(jìn)行細胞周期分析對指導白血病化療也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不 同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。
急性白血病的多耐藥基因(MDR)也常用FCM檢測，FCM特有的敏感性和特異性，用于檢測二氨基苯茚酮 mRNA的表達產(chǎn)物 P糖蛋白(Pgp)及其活性(作為藥物的排出泵，降低細胞內藥物濃度)，可以更直接的反映耐藥程度。
陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種造血干細胞克隆病,細胞 CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個(gè)特點(diǎn)。
FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞 CD59的表達做定量分析，可以協(xié)助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度。
網(wǎng)織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標。
FCM通過(guò)某些熒光染料(吖啶橙等)與紅細胞中 RNA結合，定量測定網(wǎng)織紅細胞中 RNA，得到網(wǎng)織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。
有報道認為[6]FCM比目測法的精確度更高。
此外，FCM還可以測量出網(wǎng)織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義，為干細胞移植術(shù)后恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤患者放、化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據。
造血干/祖細胞計數造血干/祖細胞具有自我復制和多向分化潛能，是各種血細胞和免疫細胞的始祖。
造血干/祖細胞計數對造血干細胞移植意義重大。
CD34抗原是早期造血干/祖細胞的表面標志，應用 FCM分析、計數 CD34 細胞已成為造血干/祖細胞移植、造血重建的重要指標。
由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白的表達水平的高低來(lái)判斷,FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況可以診斷血小板膜糖蛋白異常所致疾病,這類(lèi)疾病很少見(jiàn)但病因明確,主要是GpⅡb/Ⅲa或GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ缺陷所致。
患者血小板膜GpⅡb/Ⅲa的缺乏,導致血小板聚集功能明顯低下,這就是常染色體隱性遺傳病-血小板無(wú)力癥。
而巨血小板綜合征是由于GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ復合物數量或質(zhì)量的缺陷導致的遺傳性出血性疾病。
FCM還可以通過(guò)單抗免疫熒光標記血小板膜糖蛋白監測血小板功能及活化情況,評價(jià)活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前狀態(tài)發(fā)生發(fā)展中的作用,有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療,此外血小板活化時(shí)細胞內的鈣離子濃度是活化血小板監測的一項非免疫性指標,免疫性血小板減少性紫癜患者血漿中可產(chǎn)生血小板自身抗體,結合在血小板表面,稱(chēng)為血小板相關(guān)抗體,檢測血小板表面或血清中的相關(guān)抗體,可用于該病的診斷及治療監測[7]。
3 流式細胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應用�
FCM在腫瘤學(xué)中的應用主要是利用DNA含量測定進(jìn)行包括癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導以及預后評估等工作,FCM可精確定量DNA含量,能對癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢做出判斷,有助于癌變的早期診斷[6]。
首先需要把實(shí)體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液,用熒光染料(碘化吡啶P1)染色后對細胞的DNA含量進(jìn)行分析,將不易區分的群體細胞分成三個(gè)亞群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表細胞的倍體狀態(tài),非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關(guān)。
DNA非整倍體細胞峰存在可為腫瘤診斷提供有力依據[6]。
腫瘤細胞DNA倍體分析對患者預后的判斷亦有重要作用。
異倍體腫瘤惡性病變的復發(fā)率、轉移率及死亡率均較高,而二倍體及近二倍體腫瘤的預后則較好。
FCM不僅可以對惡性腫瘤DNA含量進(jìn)行分析,還可根據化療過(guò)程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效,了解細胞動(dòng)力學(xué)變化,對腫瘤化療具有重要的意義。
臨床醫師可以根據細胞周期各時(shí)相的分布情況,依據化療藥物對細胞動(dòng)力學(xué)的干擾理論,設計最佳治療方案。
從DNA直方圖直接地看到腫瘤細胞的殺傷變化,及時(shí)選用有效的藥物對腫瘤細胞達到最大的殺傷效果。
4 流式細胞術(shù)在細胞凋亡和多藥耐藥基因中的應用�
細胞凋亡是機體生長(cháng)發(fā)育、細胞分化和病理狀態(tài)中細胞死亡的過(guò)程,凋亡典型的形態(tài)特征是核染色質(zhì)固縮并分離,細胞質(zhì)濃縮,細胞膜和核膜皺曲,核斷裂形成片斷,最后形成數量不等的凋亡小體。
FCM可以進(jìn)行DNA含量分析,通過(guò)二倍體細胞G0/G1期峰前的亞二倍體峰來(lái)確定。
在凋亡早期,一些與膜通透性改變及凋亡有關(guān)的蛋白在細胞膜表面有特定表達。
通過(guò)FCM結合單克隆抗體可以檢測表達這些蛋白的細胞,從而確定細胞的凋亡情況。
多重耐藥性(multidrugresistance,MDR)是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白(P-gp)親脂化合物,包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。
從人淋巴細胞排除熒光染料與細胞內P-gp的含量直接相關(guān)。
當淋巴細胞出現MDR陽(yáng)性細胞時(shí),患者對化療藥物開(kāi)始出現耐藥性,需要考慮其它治療方式。
多藥耐藥是腫瘤患者化療失敗的主要原因,FCM對多藥耐藥基因(如P170)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定,可為臨床治療效果分析提供有力依據[8]。
5 流式細胞術(shù)在器官移植中的應用�
FCM在器官移植中占有重要地位,可被用來(lái)判斷供者與受者之間是否合適,用來(lái)鑒別和定型同種異體反應抗體[6]。
通過(guò)供者白細胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在針對供者的循環(huán)抗體,就會(huì )同供者的淋巴細胞結合,再加入熒光素標記的二抗來(lái)顯示這種結合,此方法能在移植手術(shù)前發(fā)現高風(fēng)險的受體。
移植后免疫表型的監測也很重要。
FCM可用于檢測移植后血液或移植內免疫成分的變化,以預防移植后免疫�
排斥反應,細胞免疫抑制治療效果和移植存活情況,可敏感地預測排斥反應的發(fā)生,為臨床治療提供有效依據。
6 流式細胞術(shù)在臨床細菌學(xué)中的應用�
流式細胞術(shù)在臨床細菌學(xué)中的應用具有快捷、靈敏,能同時(shí)進(jìn)行多參數分析等優(yōu)點(diǎn),可廣泛用于細菌、病原體、毒素和血清抗體及藥敏試驗。
免疫熒光檢測方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一個(gè)新應用。
這種方法也可用于真菌、寄生蟲(chóng)、病毒以及這些病原體的混合感染的檢測。
近年來(lái),FCM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細菌的活力和功能狀態(tài),由于速度快,該方法已被建議作為臨床實(shí)驗室的常規藥敏試驗。
FCM藥敏檢測方法較多,通過(guò)測量加入藥物孵育后的散射光的DNA含量來(lái)判斷抗生素對細菌的敏感性。
該法現被認為是FCM在該領(lǐng)域應用的經(jīng)典方法[6]。
7 FCM在細胞生物學(xué)中的應用�
在細胞周期內,DNA含量隨時(shí)相發(fā)生周期性的變化,通過(guò)熒光探針對細胞進(jìn)行相對DNA含量測定,可分析細胞周期各時(shí)相細胞的百分比,周期動(dòng)力學(xué)參數以及DNA異倍體。
可利用與鈣離子特異結合的熒光染料和激發(fā)光譜或發(fā)射光譜是pH值依賴(lài)熒光染料進(jìn)行細胞內鈣離子濃度測定和細胞內pH值測定[9]。
8 流式細胞術(shù)在優(yōu)生遺傳領(lǐng)域中的應用�
流式細胞術(shù)可使含量極微的胎兒有核紅細胞得到富集,因為有核紅細胞含有胎兒的全部基因,并具有不影響多胎妊娠等優(yōu)點(diǎn),結合FISH,PCR等技術(shù),使之具有應用于無(wú)創(chuàng )性產(chǎn)前診斷的廣闊前景[10]。
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流式細胞術(shù)在臨床檢驗中的應用【2】
摘要 目的：通過(guò)了解和討論，對流式細胞術(shù)在臨床檢驗中的應用情況做出詳細分析。
方法：通過(guò)多次嚴謹性實(shí)驗并且真實(shí)詳細記錄每次實(shí)驗數據，進(jìn)一步分析流式細胞術(shù)在臨床檢驗中的應用效果和可行性。
結果：經(jīng)過(guò)實(shí)驗數據分析，流式細胞術(shù)在檢驗HLA-B27抗原、淋巴細胞亞群、腫瘤標志物、白血病免疫、臨床微生物等應用中有著(zhù)明顯的效果。
結論：流式細胞術(shù)在臨床檢驗中可以得到很好的應用。
關(guān)鍵詞 流式細胞術(shù);流式細胞儀;臨床檢驗;應用
流式細胞術(shù)是一種生物學(xué)技術(shù)，用流式細胞儀(FACS)對懸浮于流體中的微小顆粒進(jìn)行計數和分選。
這種技術(shù)可以用來(lái)對流過(guò)光學(xué)或電子檢測器的一個(gè)個(gè)細胞進(jìn)行連續的多種參數分析。
流式細胞術(shù)(FCM)是對懸液中的單細胞或其他生物粒子，通過(guò)檢測標記的熒光信號，實(shí)現高速、逐一的細胞定量分析和分選的技術(shù)。
FCM不但快速、靈敏而且還可以同時(shí)對多個(gè)參數進(jìn)行分析，FCM在臨床微生物檢測中的作用受到越來(lái)越多人的關(guān)注。
FCM不但可以用來(lái)檢測受染細胞內的病毒抗原，而且還可以對受染細胞表面的病毒抗原進(jìn)行檢測。
由于FCM檢測的一般只是單個(gè)細胞，因此經(jīng)過(guò)FCM檢測的受染細胞只適用于支氣管灌洗液、血液、尿標本以及一些經(jīng)酶消化過(guò)的組織細胞，同時(shí)由于FCM進(jìn)行的是多參數分析。
所以FCM體外抗生素藥敏試驗的主要機制是，通過(guò)FCM檢測病原體和染料結合在一起后所發(fā)出的不同強度的熒光。
從而間接地反映出病原體的功能狀態(tài)以及活性，以達到幫助判斷病原體對抗生素的反應性目的，其中用于研究抗菌效應的熒光染料主要有2大類(lèi)：其中用來(lái)標記DNA和RNA的染料主要包括如溴化乙錠、碘化丙啶等;其次是用來(lái)反映代謝活性或結合蛋白的探針，其中包括異硫氰酸熒光素、膜電位敏感性染料等。
怎樣選擇這些物質(zhì)，與這種染料本身的發(fā)射特性有關(guān)，同時(shí)抗生素的作用機制也可能關(guān)系到這些物質(zhì)的選擇。
近年來(lái)FCM在細菌的藥敏效應的研究領(lǐng)域已獲成功，將這些熒光染料和FCM聯(lián)合運用到一起，可以判斷其細菌活力與功能狀態(tài)，這種方法由于有速度快等優(yōu)勢，臨床實(shí)驗室的常規藥敏試驗中也應用到這種方法。
方法
本實(shí)驗用到的細胞定量分析和分選技術(shù)，這個(gè)技術(shù)要用的實(shí)驗細胞包括MCF7、293(T)、U20S等。
以U20S細胞為例，他們通常所用的操作方法：首先對細胞進(jìn)行培養以及鋪板，轉染、細胞分板、上機樣本制備、加藥刺激、細胞收獲及處理、相關(guān)試劑配制等步驟。
其中在細胞培養時(shí)，以U20S細胞作為細胞株和材料，在這個(gè)過(guò)程我們要注意的是一瓶細胞總數一般情況下會(huì )達到1×107個(gè)。
在鋪板的過(guò)程首先要對細胞進(jìn)行分化，然后才對細胞進(jìn)行計數，計數時(shí)如果發(fā)現細胞密度很大，影響計數，就必須對細胞進(jìn)行合適倍數的稀釋后才計數。
最后才能進(jìn)行鋪板。
鋪板的過(guò)程是：首先在6cm培養皿按照每孔6×105個(gè)的數量加入細胞，然后將6cm培養皿沿水平面方向前后左右來(lái)回晃動(dòng)，使細胞能夠均勻分布，晃動(dòng)時(shí)要小心以防止培養液潑出，再將細胞放置培養箱里生長(cháng)。
將這些過(guò)程都完成后，然后可以用轉染色劑Lipofectamin2000進(jìn)行轉染操作，其操作過(guò)程：首先在DEF-FN載體上構建目的基因質(zhì)粒，當細胞密度為達到50%～60%時(shí)，再進(jìn)行轉染操作，轉染12～16h后，再根據細胞密度按1：3進(jìn)行分板，使分板后細胞密度30%左右。
除了以轉染質(zhì)粒作為陽(yáng)性對照外，我們還可以以藥物處理細胞作為陽(yáng)性對照。
將細胞鋪板24h后，再加藥對其進(jìn)行刺激，加藥培養24h后，然后就可以對細胞進(jìn)行收獲處理了。
注意在這個(gè)過(guò)程中要分別對培養液進(jìn)行收集，在每個(gè)6cm規格的板中加入1mL胰酶進(jìn)行消化。
待消化完畢后，再向內一一對應地加入已收集的培養液來(lái)中和胰酶。
上述過(guò)程進(jìn)行完之后，最少要放置4h，才能從將細胞樣本從冰箱里取出進(jìn)行離心操作來(lái)收集細胞。
將1×PBS清洗2遍后，再加入100μL 1×PBS將兩者混勻，加入10μL PI(終濃度100μg/mL)，10μLRnase(終濃度50μg/mL)，置于37℃水浴鍋，避光處理30min。
這樣才算完成上機樣本制備。
在處理分選細胞樣本前，要對細胞進(jìn)行貼壁培養，每個(gè)細胞樣本至少需要1個(gè)10cm規格的細胞板，去除培養液酶消化，在37℃條件下充分消化至細胞輕拍脫壁，再加入5mL培養液進(jìn)行中和，以充分分散細胞，取100μL細胞上機，測定轉染效率，剩余細胞計數、離心，根據轉染效率，分選模式，調節細胞濃度，達到上樣速率1000～3000個(gè)/s。
結果
經(jīng)過(guò)實(shí)驗分析得出結果，將其用于病毒檢測具有以下優(yōu)點(diǎn)及可行性：可在單個(gè)細胞中同時(shí)獲得多個(gè)分析參數;能定量檢出受染細胞，當用不同熒光染料標記不同的病毒抗原特異性抗體或將特異性病毒抗體與不同大小的乳膠顆粒相聯(lián)時(shí)，FCM可同時(shí)檢測到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原，這種方法也可用于真菌、寄生蟲(chóng)、病毒以及這些病原體混合感染的檢測。
討論
隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細胞技術(shù)也取得了快速的發(fā)展，其臨床應用越來(lái)越廣泛，在臨床工作中發(fā)揮著(zhù)重要的作用。
流式細胞術(shù)已普遍應用于免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫學(xué)和基礎醫學(xué)研究領(lǐng)域。
隨著(zhù)對FCM研究的日益深入，其價(jià)值已經(jīng)從科學(xué)研究走人了臨床應用階段，在我國臨床醫學(xué)領(lǐng)域里已有著(zhù)廣泛的應用。
可見(jiàn)流式細胞術(shù)在臨床檢驗的應用具有很好的發(fā)展前景和可靠性。
光子學(xué)在信息處理應用中的進(jìn)展
光子學(xué)在信息處理應用中的進(jìn)展
評述光子學(xué)在印刷、數據存儲、圖像處理、光計算和量子計算中的`應用.
作 者：邱元武 QIU Yuanwu 作者單位：上海同濟大學(xué)物理系,上海,200092 刊 名：激光與光電子學(xué)進(jìn)展 ISTIC PKU英文刊名：LASER & OPTOELECTRONICS PROGRESS 年，卷(期)：2005 42(3) 分類(lèi)號： 關(guān)鍵詞：光子學(xué) 光子技術(shù)應用 信息處理