培養基滅菌要(培養基的制備與滅菌的實(shí)驗中配制培養基時(shí)要注意哪些問(wèn)題)
1.培養基的制備與滅菌的實(shí)驗中配制培養基時(shí)要注意哪些問(wèn)題
1、常用玻璃儀器的準備 制備培養基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用.（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用.（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用.（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用.其他玻璃器皿均應按上法處理，也應裝金屬筒內160℃干熱滅菌2h后，備用.2、培養基的制備及儲存 （1）溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷齊內.加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應經(jīng)常攪拌，防止焦結，待其溶解后補足水分.在使用干燥培養基時(shí)，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱(chēng)取一定量培養基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長(cháng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，溫度不宜過(guò)高，避免某些營(yíng)養成分被破壞.（2）校正酸堿度（調節pH）：培養基必須有適當的pH.因此測定pH是培養基配制過(guò)程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃.調節pH可用無(wú)菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液.當調節緩沖液的pH時(shí)，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液.滅菌后的pH會(huì )比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養基的pH會(huì )比最終pH調高0.2左右，滅菌后基本合適.因此對培養基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測定，并記下每次pH的測定結果，有助于積累數據考察每種培養基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導滅菌前pH的調節.干燥培養基一般已校正過(guò)pH，用時(shí)也必須再驗證.測定時(shí)，一般用指示劑滴入培養基觀(guān)察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正.調整pH后要加熱過(guò)濾，使培養基澄清.（3）培養基的分裝：大批量配制時(shí)使用的自動(dòng)分配器須經(jīng)校準和確認.每次使用前后，均要對分配器的管道系統進(jìn)行沖洗，在分裝無(wú)菌培養基前，則要采用無(wú)菌硅膠管.固體培養基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據需要分裝平皿或試管.平皿：傾注平皿，應在無(wú)菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養箱 中倒置30—60min.讓水蒸汽自然蒸發(fā).斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養基，如沾有培養基應用布抹去，以避免污染.高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用.分裝好的培養基或緩沖液等及時(shí)密封后必須在配制當天（2h內最佳）進(jìn)行滅菌處理.液體、半固體培養基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中.培養基的滅菌：培養基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定.普通培養基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時(shí)，應延長(cháng)至20min.含糖培養基115℃、68.85kPa滅菌30min.含糖、血清、雞蛋等培養基可用流動(dòng)蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續3d，間歇滅菌.血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細菌過(guò)濾器，過(guò)濾除菌.高壓滅菌應嚴格按照操作規程執行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內的空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時(shí)間，達到全部殺滅微生物.以上的滅菌時(shí)間和溫度要經(jīng)過(guò)驗證確認，如不同類(lèi)型培養基混合一起滅菌時(shí)宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好.。
2.培養基消毒需要注意什么?
滅菌培養基配制過(guò)程中，所用的玻璃器皿要洗滌干凈，不能帶 有雜質(zhì)。
可先用清水沖洗，再浸人洗衣粉液中浸泡，用刷子內 外刷洗，沖凈，再用蒸餾水沖洗1 ~2次，放人150°C的烘箱 中，干熱滅菌1小時(shí)后備用。吸管、量筒等難以洗滌的要先放 人洗液中浸泡2小時(shí)，再用清水沖洗。
培養基的消毒、滅菌，一般采用高壓蒸氣鍋蒸10 ~20分 鐘。在培養基消毒、滅菌時(shí)，可把接種植物材料用的蒸餾水盛 入三角瓶中，用棉塞塞緊，牛皮紙包裹瓶口，再用橡皮筋捆扎。
將懾子、剪刀、刀子等用具用布墊包裹或放人鋁制飯盒中，與 培養基一起放人高壓鍋中消毒。培養基消毒后取出放人搪瓷 盤(pán)中，將盤(pán)子放入平坦的桌面上，讓培養基冷卻、凝固。
3.培養基的滅菌方法有哪些
培養基的滅菌方法1、高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養基、接種器械和蒸餾水的滅菌。
培養基在愛(ài)制備過(guò)程中混入各種雜菌，分裝后應立即滅菌，至少應在24h內完成滅菌工作。滅菌時(shí)一般是在0。
105MPa壓力下，溫度121℃時(shí)，滅菌15~30min即可。 消毒時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，也不能超過(guò)規定的壓力范圍，否則有機物質(zhì)特別是維生素類(lèi)物質(zhì)就會(huì )在高溫下分解，失去營(yíng)養作用，也會(huì )使培養基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。
將蒸餾水或自來(lái)水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過(guò)瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無(wú)菌水。 滅菌后的培養基可放到培養室中預培養3d，若無(wú)污染現象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。
暫時(shí)不用的培養基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養基應在1周內用完，其他培養基最多也不要超過(guò)1個(gè)月。
2、過(guò)濾滅菌：一些植物生長(cháng)調節劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養基一起進(jìn)行高溫滅菌，而要使用細菌過(guò)濾器濾去其中的雜菌。 細菌過(guò)濾器與濾膜（孔徑0。
45微米）使用之前要先進(jìn)行高壓滅菌。過(guò)濾后的溶液要立即加入培養基中，若為液體培養基，可在培養基冷卻至30℃時(shí)加入；若為固體培養基，必須在培養基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
4.培養基的滅菌流程
原理 培養基是供微生物生長(cháng)、繁殖、代謝的混合養料。
由于微生物具有不同的營(yíng)養類(lèi)型，對營(yíng)養物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗和研究的目的不同，所以培養基的種類(lèi)很多，使用的原料也各有差異，但從營(yíng)養角度分析，培養基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無(wú)機鹽、生長(cháng)素以及水分等。另外，培養基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。
瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養基在98~100℃下融化，于45℃以下凝固。
但多次反復融化，其凝固性降低。任何一種培養基一經(jīng)制成就應及時(shí)徹底滅菌，以備純培養用。
一般培養基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。3材料3.1器皿及材料 天平、稱(chēng)量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養皿及培養皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線(xiàn)繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。
3.2藥品試劑 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。4流程 稱(chēng)藥品→溶解→調pH值→融化瓊脂→過(guò)濾分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板。
5步驟5.1培養基的制備5.1.1稱(chēng)量藥品 根據培養基配方依次準確稱(chēng)取各種藥品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。
5.1.2溶解 用量筒取一定量（約占總量的1/2）蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補足水分。
如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補足水分。5.1.3調節pH 根據培養基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調至所需pH。
測定pH可用pH試紙或酸度計等。5.1.4溶化瓊脂 固體或半固體培養基須加入一定量瓊脂。
瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補足水分（水需預熱）。注意控制火力不要使培養基溢出或燒焦。
5.1.5過(guò)濾分裝 先將過(guò)濾裝置安裝好（圖3-1）。如果是液體培養基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過(guò)濾。
過(guò)濾后立即進(jìn)行分裝。分裝時(shí)注意不要使培養基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞， 引起污染。
液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜。
5.1.6包扎標記 培養基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標明培養基名稱(chēng)，制備組別和姓名、日期等。
5.1.7滅菌 上述培養基應按培養基配方中規定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養基的有效成份。
培養基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養基，則滅菌后立即擺放成斜面（圖3-2），斜面長(cháng)度一般以不超過(guò)試管長(cháng)度的1/2為宜；半固體培養基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。5.1.8倒平板 將需倒平板的培養基，于水浴鍋中冷卻到45~50℃，立刻倒平板。
5.2滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類(lèi)。本實(shí)驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。
加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過(guò)加熱使菌體內蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到殺菌目的。
蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。
5.2.1.高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著(zhù)蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。
當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15~30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌（圖3-4）。
5.2.1.1操作方法和注意事項如下 加水 打開(kāi)滅菌鍋蓋，向鍋內加水到水位線(xiàn)。立式消毒鍋最好用已煮開(kāi)過(guò)的水，以便減少水垢在鍋內的積存。
注意水要加夠，防止滅菌過(guò)程中干鍋。裝料、加蓋 滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。
排氣 打開(kāi)排氣口（也叫放氣閥）。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內冷空氣完全排凈。
升壓、保壓和降壓 當鍋內冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開(kāi)始上升。當壓力上升至所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開(kāi)始計算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達到要求（一般培養基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時(shí)，打開(kāi)放氣。
5.微生物實(shí)驗中培養基的配置應該注意什么
1、常用玻璃儀器的準備 制備培養基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用.（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用.（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用.（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用.其他玻璃器皿均應按上法處理，也應裝金屬筒內160℃干熱滅菌2h后，備用.2、培養基的制備及儲存 （1）溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷齊內.加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應經(jīng)常攪拌，防止焦結，待其溶解后補足水分.在使用干燥培養基時(shí)，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱(chēng)取一定量培養基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長(cháng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，溫度不宜過(guò)高，避免某些營(yíng)養成分被破壞.（2）校正酸堿度（調節pH）：培養基必須有適當的pH.因此測定pH是培養基配制過(guò)程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃.調節pH可用無(wú)菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液.當調節緩沖液的pH時(shí)，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液.滅菌后的pH會(huì )比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養基的pH會(huì )比最終pH調高0.2左右，滅菌后基本合適.因此對培養基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測定，并記下每次pH的測定結果，有助于積累數據考察每種培養基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導滅菌前pH的調節.干燥培養基一般已校正過(guò)pH，用時(shí)也必須再驗證.測定時(shí)，一般用指示劑滴入培養基觀(guān)察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正.調整pH后要加熱過(guò)濾，使培養基澄清.（3）培養基的分裝：大批量配制時(shí)使用的自動(dòng)分配器須經(jīng)校準和確認.每次使用前后，均要對分配器的管道系統進(jìn)行沖洗，在分裝無(wú)菌培養基前，則要采用無(wú)菌硅膠管.固體培養基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據需要分裝平皿或試管.平皿：傾注平皿，應在無(wú)菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養箱 中倒置30—60min.讓水蒸汽自然蒸發(fā).斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養基，如沾有培養基應用布抹去，以避免污染.高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用.分裝好的培養基或緩沖液等及時(shí)密封后必須在配制當天（2h內最佳）進(jìn)行滅菌處理.液體、半固體培養基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中.培養基的滅菌：培養基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定.普通培養基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時(shí)，應延長(cháng)至20min.含糖培養基115℃、68.85kPa滅菌30min.含糖、血清、雞蛋等培養基可用流動(dòng)蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續3d，間歇滅菌.血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細菌過(guò)濾器，過(guò)濾除菌.高壓滅菌應嚴格按照操作規程執行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內的空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時(shí)間，達到全部殺滅微生物.以上的滅菌時(shí)間和溫度要經(jīng)過(guò)驗證確認，如不同類(lèi)型培養基混合一起滅菌時(shí)宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好.。
6.在微生物培養中,對培養基常用什么法進(jìn)行滅菌
培養基的滅菌方法
1、高壓蒸汽滅菌：
高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養基在愛(ài)制備過(guò)程中混入各種雜菌，分裝后應立即滅菌，至少應在24h內完成滅菌工作。滅菌時(shí)一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時(shí)，滅菌15~30min即可。消毒時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，也不能超過(guò)規定的壓力范圍，否則有機物質(zhì)特別是維生素類(lèi)物質(zhì)就會(huì )在高溫下分解，失去營(yíng)養作用，也會(huì )使培養基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來(lái)水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過(guò)瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無(wú)菌水。 滅菌后的培養基可放到培養室中預培養3d，若無(wú)污染現象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。暫時(shí)不用的培養基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養基應在1周內用完，其他培養基最多也不要超過(guò)1個(gè)月。
2、過(guò)濾滅菌：
一些植物生長(cháng)調節劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養基一起進(jìn)行高溫滅菌，而要使用細菌過(guò)濾器濾去其中的雜菌。細菌過(guò)濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進(jìn)行高壓滅菌。過(guò)濾后的溶液要立即加入培養基中，若為液體培養基，可在培養基冷卻至30℃時(shí)加入；若為固體培養基，必須在培養基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
