ip免疫共沉淀(請教做過免疫共沉淀的高手們談談該方法和用途)

1.請教做過免疫共沉淀的高手們談談該方法和用途

飛秒檢測發(fā)現(xiàn)免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在argarose beads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內(nèi)與興趣蛋白天然結合的，符合體內(nèi)實際情況，得到的結果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

免疫沉淀實驗的操作步驟比較多，同時由于在非變性條件下進行實驗，所以要得到一個完美的實驗結果，不僅需要高質(zhì)量的抗體，同時對免疫沉淀體系也需要有嚴格的控制指標。免疫沉淀實驗從：蛋白樣品處理；抗體-agarose beads孵育；抗體-agarose beads復合物洗滌到最后的鑒定，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個關鍵步驟的質(zhì)量，才能最終達到你的實驗目的。

其優(yōu)點為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。

2.什么是免疫共沉淀

免疫共沉淀基于抗原抗體特異性結合的原理，體外驗證兩種分子之間是否存在相互作用的技術。它是免疫沉淀的延伸?；驹硎窃诤幸阎乖募毎呀庖褐?，將已知抗原作為靶蛋白，檢測裂解液中可能存在與之有相互作用的蛋白。加入特定的抗體以及Protein A-Beads，會形成“抗原-抗體-Protein A-Beads”的復合物。在抗原抗體特異性結合沉淀靶蛋白的同時，存在相互作用的蛋白也能被沉淀下來，最終得到“蛋白-蛋白”的復合物。驗證是否有相互作用蛋白的存在。

免疫沉淀與免疫共沉淀實驗原理及方法大致相似，所不同的是在免疫共沉淀中對靶蛋白的結合由另一個與之發(fā)生相互作用的蛋白所替代。因此實驗屬于IP還是Co-IP取決于實驗的目標是目的抗原還是相互作用蛋白質(zhì)。