植物組織培養(yǎng)的過程,植物組織培養(yǎng)的步驟有哪些
組織培養(yǎng)的方法和步驟
要根據(jù)培養(yǎng)目的適當(dāng)選取材料植物組織培養(yǎng)的過程，選擇原則：易于誘導(dǎo)、帶菌少。要選取植物組織內(nèi)部無菌的材料。這一方面要從健壯的植株上取材料，不要取有傷口的或有病蟲的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，決不要在雨天、陰天或露水未干時(shí)取材料。因?yàn)榻训闹仓旰颓缣旃夂虾粑⒌慕M織，有自身消毒作用，這種組織一般是無菌的。培養(yǎng)材料的消毒
從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上。
第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)—吐溫。
第二步是對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌。要在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤(rùn)時(shí)間不能過長(zhǎng)。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長(zhǎng)的時(shí)間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。
第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1—2種使用見表。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用注意：①酒精滲透性強(qiáng)，幼嫩材料易在酒精中失綠，所以浸泡時(shí)間要短，防止酒精殺死植物細(xì)胞。②老熟材料，特別是種子等可以在酒精中浸泡時(shí)間長(zhǎng)一些，如種子可以浸泡5分鐘。③升汞的滲透力弱，一般浸泡10分鐘左右，對(duì)植物材料的殺傷力不大。④漂白粉容易導(dǎo)致植物材料失綠，所以對(duì)于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入濃度為0.08—0.12%的吐溫20或80（一種濕潤(rùn)劑），可以降低植物材料表面的張力，達(dá)到更好的消毒效果。滅菌劑 使用濃度(%) 持續(xù)時(shí)間（min） 去除的難易 效果
次氯酸鈣 9~10 5~30 易 很好
次氯酸鈉 2 5~30 易 很好
氯化汞 0.1~1 5~8 較難 最好
抗菌素 4~50mg/L 30~60 中 較好
制備外植體
將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷等，在無菌的環(huán)境下，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。在操作中嚴(yán)禁用手觸動(dòng)材料。
接種和培養(yǎng) （一）接種
在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養(yǎng)基上，每瓶接種1－2個(gè)，以防止交叉污染。（二）封口
接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口。 （三）溫度
培養(yǎng)基大多應(yīng)保持在25℃左右，但要因花卉種類及材料部位的不同而區(qū)別對(duì)待。
增殖
外植體的增殖是組培的關(guān)鍵階段，在新梢等形成后為了擴(kuò)大繁殖系數(shù)，需要繼代培養(yǎng)。把材料分株或切段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基一般在分化培養(yǎng)基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1個(gè)月左右后，可視情況進(jìn)行再增殖。
根的誘導(dǎo)
繼代培養(yǎng)形成的不定芽和側(cè)芽等一般沒有根，必須轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。1個(gè)月后即可獲得鍵壯根系。
組培苗的煉苗移栽 試管苗從無菌到光、溫、濕穩(wěn)定的環(huán)境進(jìn)入自然環(huán)境，必須進(jìn)行煉苗。一般移植前，先將培養(yǎng)容器打開，于室內(nèi)自然光照下放3天，然后取出小苗，用自來水把根系上的營(yíng)養(yǎng)基沖洗干凈，再栽入已準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，基質(zhì)使用前最好消毒。移栽前要適當(dāng)遮蔭，加強(qiáng)水分管理，保持較高的空氣濕度（相對(duì)濕度98％左右），但基質(zhì)不宜過濕，以防爛苗。
植物組織培養(yǎng)方法 1 MS培養(yǎng)基的配制包括以下步驟.
培養(yǎng)基母液的配制和保存 MS培養(yǎng)基含有近30種營(yíng)養(yǎng)成分,為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對(duì)這幾十種成分進(jìn)行稱量,可將培養(yǎng)基中的各種成分,按原量的20倍或200倍分別稱量,配成濃縮液,這種濃縮液叫做培養(yǎng)基母液.這樣每次使用時(shí),取其總量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL）,加水稀釋,制成培養(yǎng)液.現(xiàn)將制備培養(yǎng)基母液所需的各類物質(zhì)的量列出,供配制時(shí)使用.
大量元素(母液Ⅰ) mg／L
NH4NO3 33 000
KNO3 38 000
CaCl2·2H2O 8 800
MgSO4·7H2O 7 400
KH2PO4 3 400
微量元素(母液Ⅱ)
KI 166
H3BO3 1 240
MnSO4·4H2O 4 460
ZnSO4·7H2O 1 720
Na2MoO4·2H2O 50
CuSO4·5H2O 5
CoCl2·6H2O 5
鐵鹽(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O 5 560
Na2-EDTA·2H2O 7 460
有機(jī)成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇 20 000
ⅣB
煙酸 100
鹽酸吡哆醇(維生素B6) 100
鹽酸硫胺素(維生素B1) 100
甘氨酸 400
以上各種營(yíng)養(yǎng)成分的用量,除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外,其余的均為200倍濃縮液.
上述幾種母液都要單獨(dú)配成1 L的貯備液.其中,母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢后,分別用少量的蒸餾水徹底溶解,然后再將它們混溶,最后定容到1 L.
母液Ⅲ的配制方法是：將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450 mL蒸餾水中,邊加熱邊不斷攪拌使它們?nèi)芙?然后將兩種溶液混合,并將pH調(diào)至5.5,最后定容到1 L,保存在棕色玻璃瓶中.
各種母液配完后,分別用玻璃瓶貯存,并且貼上標(biāo)簽,注明母液號(hào)、配制倍數(shù)、日期等,保存在冰箱的冷藏室中.
MS培養(yǎng)基中還需要加入2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6BA）等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì),并且分別配成母液（0.1 mg/mL）.其配制方法是：分別稱取這3種物質(zhì)各10 mg,將2,4-D和NAA用少量（1 mL）無水乙醇預(yù)溶,將6BA用少量（1 mL）的物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解,溶解過程需要水浴加熱,最后分別定容至100 mL,即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的母液.
配制培養(yǎng)液 用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50 mL,母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL.再取2,4-D 5 mL、NAA 1 mL,與各種母液一起放入燒杯中.
配制培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)注意：①在使用提前配制的母液時(shí),應(yīng)在量取各種母液之前,輕輕搖動(dòng)盛放母液的瓶子,如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染,應(yīng)立即淘汰這種母液,重新進(jìn)行配制；②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前,必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2次；③量取母液時(shí),最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?量取1種,劃掉1種,以免出錯(cuò).
溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蒸糖30 g,放入1 000 mL的搪瓷量杯中,再加入蒸餾水750 mL,用電爐加熱,邊加熱邊用玻璃棒攪拌,直到液體呈半透明狀.然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中,最后加蒸餾水定容至1 000 mL,攪拌均勻.
調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中,邊滴邊攪拌,并隨時(shí)用精密的pH試紙（5.7.0）測(cè)培養(yǎng)基的pH,一直到培養(yǎng)基的pH為5.8為止（培養(yǎng)基的pH必須嚴(yán)格控制在5.8）.
2 BA為細(xì)胞分裂素 NAA 是萘乙酸,為生長(zhǎng)素的一種
3 適于百合根的激素暫時(shí)沒找到
以下是葉片和胚的激素：對(duì)麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)葉片進(jìn)行離體培養(yǎng) ,可成功獲得無菌苗.試驗(yàn)結(jié)果表明 :培養(yǎng)基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L適于初代培養(yǎng) ,有助于根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L適于增殖培養(yǎng) ,利于愈傷組織的產(chǎn)生 ,并促進(jìn)芽的分化 ;生根培養(yǎng)基為 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;當(dāng)試管苗根長(zhǎng) 1cm時(shí)移栽易成活
在含有1 mg/ L IAA,1 m g/ L GA3,6 0 0 m g/ L CH的 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng) ,蔗糖含量為 6 8%時(shí) ,百合幼胚胚性生長(zhǎng)最好 ,培養(yǎng) 30 d后可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA,1 m g/ L BA的 MS培養(yǎng)基上可以形成淡綠色的愈傷組織 ,將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移到 1 / 2 MS無激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)可以形成大量的不定芽 ,不定芽生根移栽后 ,其成活率可達(dá)90 %以上
