植物組織培養的過(guò)程,植物組織培養的步驟有哪些

組織培養的方法和步驟

要根據培養目的適當選取材料植物組織培養的過(guò)程，選擇原則：易于誘導、帶菌少。要選取植物組織內部無(wú)菌的材料。這一方面要從健壯的植株上取材料，不要取有傷口的或有病蟲(chóng)的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，決不要在雨天、陰天或露水未干時(shí)取材料。因為健壯的植株和晴天光合呼吸旺盛的組織，有自身消毒作用，這種組織一般是無(wú)菌的。培養材料的消毒

從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養基，便會(huì )造成培養基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作手續接到培養基上。

第一步，將采來(lái)的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來(lái)水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。流水沖洗在污染嚴重時(shí)特別有用。洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來(lái)水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著(zhù)在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)—吐溫。

第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無(wú)菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時(shí)間不能過(guò)長(cháng)。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內部的材料，則可只用70%酒精處理稍長(cháng)的時(shí)間。處理完的材料在無(wú)菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內部材料。

第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類(lèi)較多，可根據情況選取1—2種使用見(jiàn)表。第四步是用無(wú)菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類(lèi)，涮洗3-l0次左右。無(wú)菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用注意：①酒精滲透性強，幼嫩材料易在酒精中失綠，所以浸泡時(shí)間要短，防止酒精殺死植物細胞。②老熟材料，特別是種子等可以在酒精中浸泡時(shí)間長(cháng)一些，如種子可以浸泡5分鐘。③升汞的滲透力弱，一般浸泡10分鐘左右，對植物材料的殺傷力不大。④漂白粉容易導致植物材料失綠，所以對于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入濃度為0.08—0.12%的吐溫20或80（一種濕潤劑），可以降低植物材料表面的張力，達到更好的消毒效果。滅菌劑 使用濃度(%) 持續時(shí)間（min） 去除的難易 效果

次氯酸鈣 9~10 5~30 易 很好

次氯酸鈉 2 5~30 易 很好

氯化汞 0.1~1 5~8 較難 最好

抗菌素 4~50mg/L 30~60 中 較好

制備外植體

將已消毒的材料，用無(wú)菌刀、剪、鑷等，在無(wú)菌的環(huán)境下，剝去芽的鱗片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。在操作中嚴禁用手觸動(dòng)材料。

接種和培養 （一）接種

在無(wú)菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養基上，每瓶接種1－2個(gè)，以防止交叉污染。（二）封口

接種后，瓶、管用無(wú)菌藥棉或蓋封口，培養皿用無(wú)菌膠帶封口。 （三）溫度

培養基大多應保持在25℃左右，但要因花卉種類(lèi)及材料部位的不同而區別對待。

增殖

外植體的增殖是組培的關(guān)鍵階段，在新梢等形成后為了擴大繁殖系數，需要繼代培養。把材料分株或切段轉入增殖培養基中，增殖培養基一般在分化培養基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1個(gè)月左右后，可視情況進(jìn)行再增殖。

根的誘導

繼代培養形成的不定芽和側芽等一般沒(méi)有根，必須轉到生根培養基上進(jìn)行生根培養。1個(gè)月后即可獲得鍵壯根系。

組培苗的煉苗移栽 試管苗從無(wú)菌到光、溫、濕穩定的環(huán)境進(jìn)入自然環(huán)境，必須進(jìn)行煉苗。一般移植前，先將培養容器打開(kāi)，于室內自然光照下放3天，然后取出小苗，用自來(lái)水把根系上的營(yíng)養基沖洗干凈，再栽入已準備好的基質(zhì)中，基質(zhì)使用前最好消毒。移栽前要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度（相對濕度98％左右），但基質(zhì)不宜過(guò)濕，以防爛苗。
植物組織培養方法 1 MS培養基的配制包括以下步驟.
培養基母液的配制和保存 MS培養基含有近30種營(yíng)養成分,為了避免每次配制培養基都要對這幾十種成分進(jìn)行稱(chēng)量,可將培養基中的各種成分,按原量的20倍或200倍分別稱(chēng)量,配成濃縮液,這種濃縮液叫做培養基母液.這樣每次使用時(shí),取其總量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL）,加水稀釋,制成培養液.現將制備培養基母液所需的各類(lèi)物質(zhì)的量列出,供配制時(shí)使用.
大量元素(母液Ⅰ) mg／L
NH4NO3 33 000
KNO3 38 000
CaCl2·2H2O 8 800
MgSO4·7H2O 7 400
KH2PO4 3 400
微量元素(母液Ⅱ)
KI 166
H3BO3 1 240
MnSO4·4H2O 4 460
ZnSO4·7H2O 1 720
Na2MoO4·2H2O 50
CuSO4·5H2O 5
CoCl2·6H2O 5
鐵鹽(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O 5 560
Na2-EDTA·2H2O 7 460
有機成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇 20 000
ⅣB
煙酸 100
鹽酸吡哆醇(維生素B6) 100
鹽酸硫胺素(維生素B1) 100
甘氨酸 400
以上各種營(yíng)養成分的用量,除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外,其余的均為200倍濃縮液.
上述幾種母液都要單獨配成1 L的貯備液.其中,母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每種母液中的幾種成分稱(chēng)量完畢后,分別用少量的蒸餾水徹底溶解,然后再將它們混溶,最后定容到1 L.
母液Ⅲ的配制方法是：將稱(chēng)好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450 mL蒸餾水中,邊加熱邊不斷攪拌使它們溶解,然后將兩種溶液混合,并將pH調至5.5,最后定容到1 L,保存在棕色玻璃瓶中.
各種母液配完后,分別用玻璃瓶貯存,并且貼上標簽,注明母液號、配制倍數、日期等,保存在冰箱的冷藏室中.
MS培養基中還需要加入2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6BA）等植物生長(cháng)調節物質(zhì),并且分別配成母液（0.1 mg/mL）.其配制方法是：分別稱(chēng)取這3種物質(zhì)各10 mg,將2,4-D和NAA用少量（1 mL）無(wú)水乙醇預溶,將6BA用少量（1 mL）的物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解,溶解過(guò)程需要水浴加熱,最后分別定容至100 mL,即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的母液.
配制培養液 用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50 mL,母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL.再取2,4-D 5 mL、NAA 1 mL,與各種母液一起放入燒杯中.
配制培養液時(shí)應注意：①在使用提前配制的母液時(shí),應在量取各種母液之前,輕輕搖動(dòng)盛放母液的瓶子,如果發(fā)現瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染,應立即淘汰這種母液,重新進(jìn)行配制；②用量筒或移液管量取培養基母液之前,必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；③量取母液時(shí),最好將各種母液按將要量取的順序寫(xiě)在紙上,量取1種,劃掉1種,以免出錯.
溶化瓊脂 用粗天平分別稱(chēng)取瓊脂9 g、蒸糖30 g,放入1 000 mL的搪瓷量杯中,再加入蒸餾水750 mL,用電爐加熱,邊加熱邊用玻璃棒攪拌,直到液體呈半透明狀.然后再將配好的混合培養液加入到煮沸的瓊脂中,最后加蒸餾水定容至1 000 mL,攪拌均勻.
調pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培養基中,邊滴邊攪拌,并隨時(shí)用精密的pH試紙（5.7.0）測培養基的pH,一直到培養基的pH為5.8為止（培養基的pH必須嚴格控制在5.8）.
2 BA為細胞分裂素 NAA 是萘乙酸,為生長(cháng)素的一種
3 適于百合根的激素暫時(shí)沒(méi)找到
以下是葉片和胚的激素：對麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)葉片進(jìn)行離體培養 ,可成功獲得無(wú)菌苗.試驗結果表明 :培養基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L適于初代培養 ,有助于根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L適于增殖培養 ,利于愈傷組織的產(chǎn)生 ,并促進(jìn)芽的分化 ;生根培養基為 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;當試管苗根長(cháng) 1cm時(shí)移栽易成活
在含有1 mg/ L IAA,1 m g/ L GA3,6 0 0 m g/ L CH的 MS培養基上培養 ,蔗糖含量為 6 8%時(shí) ,百合幼胚胚性生長(cháng)最好 ,培養 30 d后可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA,1 m g/ L BA的 MS培養基上可以形成淡綠色的愈傷組織 ,將這些愈傷組織轉移到 1 / 2 MS無(wú)激素的培養基上培養可以形成大量的不定芽 ,不定芽生根移栽后 ,其成活率可達90 %以上