質(zhì)粒常用的抽提方法(質(zhì)粒抽提的抽提方法)
1.質(zhì)粒抽提的抽提方法
質(zhì)粒抽提最常用的方法是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特點(diǎn)。關(guān)于堿裂解法的原理，復(fù)旦大學(xué)生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的網(wǎng)站有一篇專論，大家可以去看一下。這是一篇美文，非常有趣。文中提到了一個(gè)與幾乎所有能查到的資料不同的觀點(diǎn)，也是非常有啟發(fā)的。
當(dāng)然，堿裂解法也有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性；不適合大質(zhì)粒的抽提。堿裂解法是很劇烈的方法，質(zhì)粒在堿性條件下會(huì)變性，時(shí)間一長(zhǎng)，這種變性就成為不可逆的了 （電泳時(shí)在超螺旋前面一點(diǎn)點(diǎn)，如果有一條帶，就是此變性的質(zhì)粒。）。所以，要降低不可逆的變性，就要控制好堿裂解的時(shí)間。 （似乎可以做這么一個(gè)推理：在堿性條件下，質(zhì)粒的兩條鏈從一點(diǎn)或者幾個(gè)點(diǎn)開(kāi)始分開(kāi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，直到完全分開(kāi)。理論上講，完全分開(kāi)的兩條鏈要很快地配對(duì)復(fù)性，成功率肯定不可能是 100%的，而沒(méi)有完全分開(kāi)的兩條鏈卻完全可能 100% 配對(duì)復(fù)性。） 堿裂解法不適合大質(zhì)粒的抽提，原因也是因?yàn)樵摲椒ㄌ珓×遥钩菪壤^低。文獻(xiàn)推薦的抽提大質(zhì)粒的方法是溫和得多的方法，缺點(diǎn)是得率要低一些?，F(xiàn)在得問(wèn)題是，大質(zhì)粒的拷貝數(shù)本來(lái)就低，如果抽提方法得率再不高的話，抽提起來(lái)就很費(fèi)力了。如果注意到在堿裂解法中，超螺旋比例隨著堿裂解時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，隨著粘稠度的增加而減低這個(gè)現(xiàn)象，完全可以使用堿裂解法來(lái)抽提大質(zhì)粒的：增加試劑的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分鐘內(nèi)就能變得很清澈；立即加入中和試劑。這個(gè)實(shí)驗(yàn)我們沒(méi)有做過(guò)，但 QIAGEN 抽提大質(zhì)粒用的就是堿裂解法。
2.提取質(zhì)粒有幾種 方法
實(shí)驗(yàn)一
ApaLI (178)
P(BLA) ALPHA
質(zhì)粒DNA的提取、質(zhì)粒DNA的提取、酶切 DNA的提取 及瓊脂糖凝膠電泳
ApaLI (2367)
EcoRI (397) AvaI (413)XmaI (413) SmaI (415)
APr
pUC19
BamHI (418) PstI (440)HindIII (448)
P(LAC) ORI
2686 bp
ApaLI (1121)
一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
掌握堿裂解法分離質(zhì)粒DNA的基本原理和操作要點(diǎn)。 的基本原理和操作要點(diǎn)。 掌握堿裂解法分離質(zhì)粒 的基本原理和操作要點(diǎn) 了解限制性內(nèi)切酶作用的原理、特點(diǎn)和酶切質(zhì)粒 了解限制性內(nèi)切酶作用的原理、特點(diǎn)和酶切質(zhì)粒DNA的試驗(yàn)方法 的試驗(yàn)方法 學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù) 的方法和技術(shù) 學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
二 實(shí)驗(yàn)原理
質(zhì)粒是一種染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子， 質(zhì)粒是一種染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子，具有雙鏈共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。是染色體外小型（ 200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分 DNA分子。是染色體外小型（1-200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分 分子 DNAcccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 ），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。
培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增 三個(gè)基本步驟 收集和裂解細(xì)菌 分離和純化質(zhì)粒DNA 分離和純化質(zhì)粒DNA
3.質(zhì)粒DNA的提取方法總共有哪些,回答的全給高分
堿裂解法： 此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。
方法如下： 1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。 2、37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。 4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。
7、以10,000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等體積的異戊醇，混勻后于？0℃靜置10min。 9、再以10,000rpm離心20min，棄上清。
10、用70%乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。 11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中 煮沸法 1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。
2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。 3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中， 渦旋混勻。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）， 渦旋振蕩3秒鐘。 5、將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。
6、用微量離心機(jī)4℃下12000g離心10分鐘。 7、用無(wú)菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。
8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。 酚氯仿裂解法 ① 從瓊脂平板上挑取轉(zhuǎn)化菌陽(yáng)性克隆，接種到標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)液中（含有卡那霉素30 μg/mL）搖菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min離心3 min，棄上清，沉淀加入200 μL TE，充分混勻；加入400 μL酚氯仿（1∶1體積）混合液，劇烈振動(dòng)10 s，混勻；12 000 g/min離心5 min,1 mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉淀層；上清經(jīng)國(guó)產(chǎn)0.22 μm針式濾器過(guò)濾1次；向過(guò)濾上清液內(nèi)加入2倍體積無(wú)水乙醇，振蕩10 s,12 000 g/min離心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴. ② 按PstI內(nèi)切酶說(shuō)明書進(jìn)行酶切反應(yīng)（37℃，1 h）. 酶切產(chǎn)物10 μL,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳. ③ PCR引物根據(jù)參考文獻(xiàn)〔1〕設(shè)計(jì)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為714 bp. ④ 常規(guī)制備感受態(tài)菌E.coli DH5a，提取質(zhì)粒DNA常規(guī)轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂于含有卡那霉素（30 μ/mL）LB培養(yǎng)平板中，37℃培養(yǎng)，15 h后觀察篩選克隆情況. 堿解法 操作步驟 1、細(xì)菌繁殖 LB培養(yǎng)基，2 ml/20ml,37℃，200rpm，搖一搖，過(guò)夜 2、離心10 min,5000 rpm, 4℃；棄上淸液 3、沉淀（菌體細(xì)胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min,5000 rpm, 4℃ 加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min 4、重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min 5、加入1.2 ml Solution II， 冰浴，5 min 6、加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min,12000 rpm, 4℃ 7、加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min 8、離心10 min,12000 rpm, 4℃ 9、取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中 10、加入40 ul,3 M NaAc 11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀 12、離心10 min,12000 rpm, 4℃ 13、取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
14、電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量 還有堿變性法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。
4.質(zhì)粒提取的主要步驟是什么及其作用
從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。
采用強(qiáng)堿液、加熱或溶菌酶（主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌）可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。
當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。
在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子，稱開(kāi)環(huán)DNA(Open circularDNA，簡(jiǎn)稱ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA(LinearDNA)。
當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。
5.農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA常用的提取方法
一、從在含20 mg/l Kanamycin和15 mg/l Gentamycin 5-8 ml的液體LB培養(yǎng)基中接種Agrobacterium細(xì)胞，然后在28℃、200-220 rpm培養(yǎng)24 h。
然后進(jìn)行質(zhì)粒提取。 二、新鮮配制Sol II溶液（880 l H2O, 100 l SDS 10%, 20 l 10 N NaOH），及包含 4 mg/ml溶菌酶Lysozyme 的200 l Sol I (P1)溶液。
三、對(duì)培養(yǎng)一晝夜的的Falcon試管在3600 rpm速度下進(jìn)行離心12 min，丟棄上清。 四、用200 l 5 M NaCl重懸農(nóng)桿菌細(xì)胞，利用渦旋將農(nóng)桿菌細(xì)胞混勻。
轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中。 生物幫有相關(guān)問(wèn)題的詳細(xì)介紹，分子生物學(xué)洗滌劑 /101184/。
6.質(zhì)粒DNA的大量提取和純化有哪些步驟
大提質(zhì)粒和小提質(zhì)粒的基本原理是一樣的，都是通過(guò)一定的方法（如加堿裂解）使在細(xì)菌內(nèi)大量擴(kuò)增的質(zhì)粒釋放出來(lái)，然后經(jīng)過(guò)去蛋白去RNA等一系列步驟純化DNA，最終將DNA提取出來(lái)。區(qū)別：
1.大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。
2.一般試劑盒中大提比小提多了溶菌酶、異丙醇（回收沉淀核酸）、含一定量PEG的氯化物（回收質(zhì)粒DNA）及乙酸銨等，其作用及目的都是有利于細(xì)菌的裂解和質(zhì)粒的純化，所以大提的產(chǎn)物比小提的量多很多，而且純度很高。
3.小提一般用于質(zhì)粒鑒定和對(duì)純度要求不是很高的實(shí)驗(yàn)，大提用于質(zhì)粒的大量提取和轉(zhuǎn)染等純度要求很高的實(shí)驗(yàn)。
