菌計數(shù)方法(微生物計數(shù)方法)
1.微生物計數(shù)方法有哪些
測定微生物計數(shù)的方法有很多，主要有以下幾種：
1.血細胞計數(shù)法
將稀釋的菌液樣品滴在血細胞計數(shù)板上，在顯微鏡下計算4~5個中格的細菌數(shù)，并求出每個小格所含細菌的平均數(shù)，再以此為依據(jù)，估算總菌數(shù).
①此法的缺點是不能區(qū)分死菌和活菌.
②對壓在小方格界線上的細菌，應(yīng)當(dāng)取平均值計數(shù).
③此法可用于測定培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化
2.稀釋涂布平板法
原理：每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落.培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌.
①這一方法常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目
②統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，原因是當(dāng)兩個活多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落.因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示.
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測定.但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養(yǎng)體等.
④此法若不培養(yǎng)成菌落，可通過將一定量的菌液均勻地涂布在玻片上的一定面積上，經(jīng)固定染色后在顯微鏡下計數(shù)，這樣又稱涂片計數(shù)法.染色可用臺盼藍，臺盼藍能使死細胞染成藍色，可分別計數(shù)死細胞和活細胞.
3.濾膜法
濾膜法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時，可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過膜過濾器.然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上（或一定面積上）的細菌數(shù).
此法也可以通過培養(yǎng)觀察形成的菌落數(shù)來推算樣品中的菌數(shù).例如測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目：將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng).在該培養(yǎng)基上大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色，可根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計算出水樣中大腸桿菌的數(shù)目.
此法也是統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目.
4.比濁法
原理是在一定范圍內(nèi)，菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大.因此可借助與分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量.實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確.
5.顯微鏡直接計數(shù)法
在課本生物選修1生物技術(shù)實踐P22中“除了上述活菌計數(shù)法外，顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法.”這里說的顯微鏡直接計數(shù)，我認為應(yīng)該是在稀釋涂布的基礎(chǔ)上不培養(yǎng)成菌落而通過染色的方法在顯微鏡下直接計數(shù).再如濾膜法也一樣，可以有兩種情況.
另外，微生物計數(shù)法發(fā)展迅速，多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法可以用來統(tǒng)計微生物的數(shù)目.
2.統(tǒng)計活菌數(shù)量的方法都有哪些
統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法有直接計數(shù)法和間接計數(shù)法兩種。
1. 直接計數(shù)法
直接計數(shù)法是將稀釋的樣品滴在計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計數(shù)4?5個中格的細菌數(shù)，并求出每個小格所含細菌的平均數(shù)，再按公式求出每 毫升樣品中所含的細菌數(shù)。計算公式 為：每毫升原液所含細菌數(shù)=每小格平 均細菌數(shù)X400X1 000X稀釋倍數(shù)。這種方法的優(yōu)點是所需設(shè)備比較簡單，能迅速得到結(jié)果，而且在計數(shù)的同時還可以觀察到所研究的微生物的形態(tài)特征； 缺點是不能區(qū)分死菌與活菌。
2. 間接計數(shù)法
在應(yīng)用稀釋涂布平板法計數(shù)時，首先要將待測樣品配制成均勻的系列稀釋液，盡量使微生物細胞分散開，再把稀釋液接種到平板上，進行培養(yǎng)觀察。但值得注意的是，統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌 的實際數(shù)目低，而且統(tǒng)計的結(jié)果一般用 菌落數(shù)而不用活菌數(shù)來表示。計算公式為：每克樣品中的菌落數(shù)= （C+V）X M，其中，C表示某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V表示涂布平板時所 用的稀釋液的體積（mL）,M代表稀釋倍數(shù)。
3.菌落計數(shù)有哪些的方法
原發(fā)布者：jxc2520
食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定一、培養(yǎng)基和試劑1、平板計數(shù)瓊脂（platecountagar,PCA）培養(yǎng)基成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mLpH7.0±0.2制法：將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15min。2、磷酸鹽緩沖液成分磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水500mLpH7.2制法：貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。3、無菌生理鹽水成分氯化鈉8.5g蒸餾水1000mL制法：稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。二、操作步驟樣品的稀釋1、固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1:10的樣品勻液。2、液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量
4.試述微生物活菌計數(shù)方法有哪幾種
v常用測定微生物生長的方法有：1）稱干重法。
可用離心法或過濾法測定。優(yōu)點：可適用于一切微生物，缺點：無法區(qū)別死菌和活菌。
2）比濁法。原理：由于微生物在液體培養(yǎng)時，原生質(zhì)的增加導(dǎo)致混濁度的增加，可用分光光度計測定。
優(yōu)點：比較準確。3）測含氮量，大多數(shù)微生物的含氮量占干重的比例較一致，根據(jù)含氮量再乘以6.25即可測得其粗蛋白的含量。
4）血球計數(shù)板法。優(yōu)點：簡便、快速、直觀。
缺點：結(jié)果包括死菌和活菌。5）液體稀釋法。
對未知菌樣作連續(xù)的10倍系列稀釋，經(jīng)培養(yǎng)后，記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查MPN表，再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)就可計算其中的活菌含量。優(yōu)點：可計算活菌數(shù)，較準確。
缺點：比較繁瑣。6）平板菌落計數(shù)法。
取一定體積的稀釋菌液涂布在合適的固體培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后計算原菌液的含菌數(shù)。優(yōu)點，可以獲得活菌的信息。
缺點：操作繁瑣，需要培養(yǎng)一定時間才能獲得，測定結(jié)果受多種因素的影響。
5.微生物計數(shù)方法有哪些
微生物的顯微直接計數(shù)法
一、實驗?zāi)康?/p>
了解血球計數(shù)板的構(gòu)造、計數(shù)原理和計數(shù)方法，掌握顯微鏡下直接計數(shù)的技能。
二、實驗原理
測定微生物細胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數(shù)法和平板計數(shù)法。
顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤（Petrof Hausser）細菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細菌不易看清。
血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)（圖21-1），計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。
計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為l mm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。
使用血球計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數(shù)量。
已知：1mm3體積=10 mm*10 mm*10 mm= 1000mm3
所以：1mm3體積應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3/1/4000mm3=4*106個小方格，即系數(shù)K=4*106 。
因此：每ml菌懸液中含有細胞數(shù)= 每個小格中細胞平均數(shù)（N）*系數(shù)（K）*菌液稀釋倍數(shù)（d）
三、實驗器材
1.活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養(yǎng)液。
2.器材：顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片（22mm*22mm）、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙。
四、實驗方法
1.視待測菌懸液濃度，加無菌水適當(dāng)稀釋（斜面一般稀釋到10-2），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。
2.取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。
3.將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上，不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。4.靜置片刻，將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強度。
5.計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央l個大方格的菌數(shù)（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。
6.對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)計數(shù)2—3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），求出每一個小格中細胞平均數(shù)（N），按公式計算出每ml(g)菌懸液所含酵母菌細胞數(shù)量。
7.測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，放入盒內(nèi)保存。
五、實驗作業(yè)：
將實驗結(jié)果填入下表中：
計數(shù)次數(shù) 每個大方格菌數(shù) 稀 釋
倍 數(shù) 試管斜面中的總菌數(shù) 平均值
1 2 3 4 5
第一次
第二次
6.微生物計數(shù)方法有哪些
測定微生物計數(shù)的方法有很多，主要有以下幾種：1.血細胞計數(shù)法將稀釋的菌液樣品滴在血細胞計數(shù)板上，在顯微鏡下計算4~5個中格的細菌數(shù)，并求出每個小格所含細菌的平均數(shù)，再以此為依據(jù)，估算總菌數(shù).①此法的缺點是不能區(qū)分死菌和活菌.②對壓在小方格界線上的細菌，應(yīng)當(dāng)取平均值計數(shù).③此法可用于測定培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化2.稀釋涂布平板法原理：每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落.培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌.①這一方法常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目②統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，原因是當(dāng)兩個活多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落.因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示.③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測定.但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養(yǎng)體等.④此法若不培養(yǎng)成菌落，可通過將一定量的菌液均勻地涂布在玻片上的一定面積上，經(jīng)固定染色后在顯微鏡下計數(shù)，這樣又稱涂片計數(shù)法.染色可用臺盼藍，臺盼藍能使死細胞染成藍色，可分別計數(shù)死細胞和活細胞.3.濾膜法濾膜法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時，可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過膜過濾器.然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上（或一定面積上）的細菌數(shù).此法也可以通過培養(yǎng)觀察形成的菌落數(shù)來推算樣品中的菌數(shù).例如測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目：將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng).在該培養(yǎng)基上大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色，可根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計算出水樣中大腸桿菌的數(shù)目.此法也是統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目.4.比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大.因此可借助與分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量.實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確.5.顯微鏡直接計數(shù)法在課本生物選修1生物技術(shù)實踐P22中“除了上述活菌計數(shù)法外，顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法.”這里說的顯微鏡直接計數(shù)，我認為應(yīng)該是在稀釋涂布的基礎(chǔ)上不培養(yǎng)成菌落而通過染色的方法在顯微鏡下直接計數(shù).再如濾膜法也一樣，可以有兩種情況.另外，微生物計數(shù)法發(fā)展迅速，多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法可以用來統(tǒng)計微生物的數(shù)目。
7.1.測定微生物數(shù)量的方法有哪些
細菌計數(shù)1.計數(shù)器測定法：
即用血細胞計數(shù)器進行計數(shù)。取一定體積的樣品細胞懸液置于血細胞計數(shù)器的計數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀察計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的（O.1mm3），因而根據(jù)計數(shù)器刻度內(nèi)的細菌數(shù)，可計算樣品中的含菌數(shù)。本法簡便易行，可立即得出結(jié)果。
本法不僅適于細菌計數(shù)，也適用于酵母菌及霉菌孢子計數(shù)。
2、電子計數(shù)器計數(shù)法：
電子計數(shù)器的工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個細胞，當(dāng)一個細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄裝置上。
該法測定結(jié)果較準確，但它只識別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。
3、活細胞計數(shù)法
常用的有平板菌落計數(shù)法，是根據(jù)每個活的細菌能長出一個菌落的原理設(shè)計的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高，是一種檢測污染活菌數(shù)的方法，也是目前國際上許多國家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意：①一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進行計數(shù)，過多或過少均不準確；②為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入O.001%2,3,5一氯化三苯基四氮唑（TTC）；③本法限用于形成菌落的微生物。
廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細菌檢驗，是最常用的活菌計數(shù)法。
4、比濁法
比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測定細菌的數(shù)量。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度（OD值）表示樣品菌液濃度。
此法簡便快捷，但只能檢測含有大量細菌的懸浮液，得出相對的細菌數(shù)目，對顏色太深的樣品，不能用此法測定。
5、測定細胞重量法
此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進行稱重；干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后，以清水洗凈放人干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱重。
此法適于菌體濃度較高的樣品，是測定絲狀真菌生長量的一種常用方法。
6、測定細胞總氮量或總碳量
氮、碳是細胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，測定氮、碳的含量可以推知細胞的質(zhì)量。此法適于細胞濃度較高的樣品。
7、顏色改變單位法（colour change unit，簡稱CCU）
這種方法通常用于很小，用一般的比濁法無法計數(shù)的微生物，比如支原體等，因為支原體的液體培養(yǎng)物是完全透明的，呈現(xiàn)為清亮透明紅色，因此無法用比濁法來計數(shù)，由于支原體固體培養(yǎng)很困難，用cfu法也不容易計數(shù)，因此需要用特殊的計數(shù)方法，即CCU法。它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標，來計數(shù)微生物的相對含量的，下面以解脲脲原體為例單介紹其操作：，簡
(1)取12只無菌試管，每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。
(2)在第一管加入0.2ml待測解脲脲原體菌液，充分混勻，從中吸取0.2ml加入第二管，依次類推，10倍梯度稀釋，一直到最末一管
(3)于37度培養(yǎng)，以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測菌液的CCU，也就是支原體的最大代謝活力，比如第六管出現(xiàn)顏色改變，他的相對濃度就是10的6次方CCU/ml.
一般來說，比濁法和菌落計數(shù)法就可以滿足絕大多數(shù)細菌的計數(shù)，但是對支原體這樣比較特殊的微生物，用CCU法比較合適。
8.統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法有哪些
統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法有直接計數(shù)法 和間接計數(shù)法兩種。
1. 直接計數(shù)法直接計數(shù)法是將稀釋的樣品滴在計 數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計 數(shù)4?5個中格的細菌數(shù)，并求出每個小 格所含細菌的平均數(shù)，再按公式求出每 毫升樣品中所含的細菌數(shù)。計算公式 為：每毫升原液所含細菌數(shù)=每小格平 均細菌數(shù)X400X1 000X稀釋倍數(shù)。
這 種方法的優(yōu)點是所需設(shè)備比較簡單，能 迅速得到結(jié)果，而且在計數(shù)的同時還可 以觀察到所研究的微生物的形態(tài)特征； 缺點是不能區(qū)分死菌與活菌。2. 間接計數(shù)法在應(yīng)用稀釋涂布平板法計數(shù)時，首 先要將待測樣品配制成均勻的系列稀釋 液，盡量使微生物細胞分散開，再把稀釋 液接種到平板上，進行培養(yǎng)觀察。
但值 得注意的是，統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌 的實際數(shù)目低，而且統(tǒng)計的結(jié)果一般用 菌落數(shù)而不用活菌數(shù)來表示。計算公式 為：每克樣品中的菌落數(shù)= （C+V）X M，其中，C表示某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V表示涂布平板時所 用的稀釋液的體積（mL）,M代表稀釋 倍數(shù)。
