pcr實(shí)時(shí)熒光結果分析(實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗步驟是什么)
1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗步驟是什么
變性→退火→延伸三個(gè)基本反應步驟，答：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析。
隨著(zhù)PCR反應的進(jìn)行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。我們實(shí)驗室用BIOG 染料法熒光定量PCR和BIOG探針?lè )晒舛縋CR測得的擴增曲線(xiàn)起跳值一般在30左右，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強度信號，這樣我們就可以通過(guò)熒光強度變化監測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線(xiàn)圖。
2.熒光定PCR中的注意事項
影響熒光PCR的因素很多，但從操作和技術(shù)上來(lái)講應該要注意一下幾點(diǎn)：
1. RNA的完整性
因為RNA一旦降解所定量的結果就不能正確反映樣品中mRNA的量，所得的結果也是錯誤的。所以在RNA提取過(guò)程中要嚴格遵守操作規范，避免RNA酶的污染。
2. RNA樣品中的基因組DNA污染
提取的RNA樣品中不可避免地混有少量的基因組DNA。基因組DNA對試驗有兩個(gè)影響：一是影響對RNA的精確定量；二是影響PCR擴增的特異性。
3. PCR反應體系的優(yōu)化
PCR擴增過(guò)程必須保證擴增產(chǎn)物只有特異的目標產(chǎn)物，為此，首先要保證PCR反應體系達到最優(yōu)。目前許多公司都有用于實(shí)時(shí)定量PCR反應的試劑盒，可以方便PCR反應的操作。
4. 反轉錄
反轉錄所得cDNA的量必須精確地等于相應的mRNA的量，反轉錄對于實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)說(shuō)是非常關(guān)鍵的一步。目前常用的反轉錄酶有2種：AMV-RT和MMLV-R。反轉錄常用的引物有隨機引物、Oligo-dT和特異引物。相比之下Oligo-dT和特異性引物更適合實(shí)時(shí)定量PCR。
5.利用實(shí)時(shí)定量PCR研究基因表達時(shí)，一般用相對定量的方法相對定量必須用到內標基因。可靠的內標基因應是在不同細胞類(lèi)型、不同試驗條件下都穩定表達的持家基因。常用的內標基因有β-tublin、actin、
GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等。盡管在大多數情況下這些持家基因的表達非常穩定，但是
最近有報道認為這些持家基因的表達在某些情況下會(huì )發(fā)生變化。也就是說(shuō)并不是任何內標基因都適合
任何試驗。在選擇內標基因時(shí)，應仔細考慮各種因素，選擇合適的內標基因或內標基因組合。
