原位雜交(原位雜交的原位雜交試驗)
1.原位雜交的原位雜交試驗
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C 保存，待用（兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。
或者使用苯锍脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成） 1. 重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。2） 置換成30%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次4） 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定（本實(shí)驗不做此步）1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(cháng)。
發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(cháng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
2. 預雜交1）每個(gè)管中置換成大約300ulHYB-溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。2）用等體積的HYB+取代HYB-。
3)60℃水浴，預雜交4小時(shí)以上。3. 雜交1）吸去預雜交的HYB+，加上100ul已加入探針的HYB+溶液（探針濃度約為1ng/ul）..2)60℃ 溫浴過(guò)夜。
注：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。 1.1）將探針回收，放于-20C保存（通常探針可重復使用十次左右）。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復一次。3）置換2XSSCT1ml,60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml,60℃，放置30分鐘，重復一次。2.1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。
2）室溫下加1ml 1:2:7溶液，時(shí)間為一小時(shí)。3）按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過(guò)夜。
1） 用1ml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室溫下顯色。4）每隔一小時(shí)觀(guān)察胚胎是否開(kāi)始顯色5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。
6)4C冰箱保存。原位雜交中溶液的配制：PBS:NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24gDEPC H2O 1LHCl 調PH值至7.4抽濾，滅菌4% 多聚甲醛：多聚甲醛 40gPBS 1L加熱持續攪拌至溶液澄清。
-20℃保存PBST:PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2gNaCl 175.5gDEPC H2O 至1L抽濾，滅菌SSCT:SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB-：甲酰胺：20XSSC儲液：DEPC水=2:1:1配制加入Tween-20使其終濃度為0.1%,-20c保存。HYB+:HYB- 20mlyeast RNA 10mgheparin 1mg。
-20℃保存。MAB:maleic acid 11.6gNaCl 8.8g用固體NaOH（約7g）調至Ph=7.54℃保存MABTMAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.10% blocking reagent:blocking reagent 8gMAB 72ml1:2:7溶液：滅活羊血清：10% BM blocking reagent:MABT=1:2:7用時(shí)現配Staining buffer:Tris 12.1gpH9.5Mgcl 6H2O 10.2g,Nacl 5.85gTween-20 1ml，用之前加1M的左旋咪唑儲液，使之終濃度為1mM。
2.原位雜交的主要程序
1、使用地高辛標記的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的RNA原位雜交第一天
1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2） 無(wú)水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
3) 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
4) PBS清洗3分鐘；
5) 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6) PBS清洗10分鐘；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分鐘；
8) PBS清洗2次，每次3分鐘；
9) 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10)PBS清洗2次，每次3分鐘；
11)0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12)PBS清洗2次，每次5分鐘；
13）預雜交緩沖液孵育30分鐘；
14）準備核酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；
15）雜交；第二天
16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；
17)PBS清洗3分鐘；
18)RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分鐘；
19)PBS清洗5分鐘；
20）室溫，2*SSC清洗10分鐘；
21)37℃，1*SSC清洗10分鐘；
22)37℃，0.5*SSC清洗10分鐘；
23）緩沖液A孵育10分鐘；
24）緩沖液A(1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100)孵育30分鐘；
25）加入抗地高辛抗體（1/200的上述緩沖液，來(lái)自Boehringer Mannheim）,37℃孵育3 小時(shí)；
26）緩沖液A清洗2次，每次10分鐘；
27）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
28）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可延長(cháng)到16小時(shí)；
29）停止緩沖液B的反應，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；
30）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復染。
2、使用地高辛標記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNA雜交第一天
1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
2） 無(wú)水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
3) 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
4) PBS清洗5分鐘；
5) 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
6) PBS清洗5分鐘；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分鐘；
8) PBS清洗2次，每次5分鐘；
9) 0.2N的HCl孵育30分鐘；
10)PBS清洗2次，每次5分鐘；
11)0.25%無(wú)水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
12)PBS清洗5分鐘；
13）預雜交緩沖液孵育30分鐘；
14）準備寡核苷酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針；
15）雜交；第二天
16）將玻片置于SSC中以去除封片；
17）室溫，2*SSC清洗10分鐘；
18)37℃，1*SSC清洗10分鐘；
19)37℃，0.5*SSC清洗10分鐘；
20）緩沖液A孵育10分鐘；
21）緩沖液A孵育30分鐘；
22）加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時(shí)；
23）緩沖液A清洗2次，每次5分鐘；
24）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
25）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可長(cháng)到16小時(shí)；
26）停止緩沖液B的反應，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；
27）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復染。
3.原位雜交的介紹
原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進(jìn)行。另有熒光原位雜交。
4.原位雜交的原位雜交試驗
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C 保存，待用（兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。
或者使用苯锍脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成） 1. 重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。2） 置換成30%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次4） 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定（本實(shí)驗不做此步）1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(cháng)。
發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(cháng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
2. 預雜交1）每個(gè)管中置換成大約300ulHYB-溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。2）用等體積的HYB+取代HYB-。
3)60℃水浴，預雜交4小時(shí)以上。3. 雜交1）吸去預雜交的HYB+，加上100ul已加入探針的HYB+溶液（探針濃度約為1ng/ul）..2)60℃ 溫浴過(guò)夜。
注：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。 1.1）將探針回收，放于-20C保存（通常探針可重復使用十次左右）。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復一次。3）置換2XSSCT1ml,60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml,60℃，放置30分鐘，重復一次。2.1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。
2）室溫下加1ml 1:2:7溶液，時(shí)間為一小時(shí)。3）按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過(guò)夜。
1） 用1ml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室溫下顯色。4）每隔一小時(shí)觀(guān)察胚胎是否開(kāi)始顯色5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。
6)4C冰箱保存。原位雜交中溶液的配制：PBS:NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g DEPC H2O 1L HCl 調PH值至7.4 抽濾，滅菌4% 多聚甲醛：多聚甲醛 40g PBS 1L 加熱持續攪拌至溶液澄清。
-20℃保存 PBST:PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2g NaCl 175.5g DEPC H2O 至1L 抽濾，滅菌 SSCT:SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB-：甲酰胺：20XSSC儲液：DEPC水=2:1:1配制 加入Tween-20使其終濃度為0.1%,-20c保存。HYB+:HYB- 20ml yeast RNA 10mg heparin 1mg。
-20℃保存。MAB:maleic acid 11.6g NaCl 8.8g 用固體NaOH（約7g）調至Ph=7.54℃保存 MABT MAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.10% blocking reagent:blocking reagent 8g MAB 72ml1:2:7溶液：滅活羊血清：10% BM blocking reagent:MABT=1:2:7 用時(shí)現配 Staining buffer:Tris 12.1g pH9.5 Mgcl 6H2O 10.2g,Nacl 5.85g Tween-20 1ml，用之前加1M的左旋咪唑儲液，使之終濃度為1mM。
5.誰(shuí)知道原位雜交怎么做
原位雜交是在分子生物學(xué)領(lǐng)域應用極為廣泛的實(shí)驗技術(shù)之一，是在研究生物體發(fā)育過(guò)程中的一種極為重要的分子遺傳學(xué)的研究方法。其英文名為in situ hybridization，其中in situ為拉丁文，原義是"in its natural position". 字面的意思理解就是說(shuō)在其原來(lái)的天然的位置處雜交。原位雜交主要是基于以下這個(gè)主要原理：?jiǎn)捂湹腄NA或者RNA只要他們的序列是互補的，即符合AT,CG的堿基配對原則，那么這樣的兩條核酸鏈之間（DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA）就可以形成一個(gè)穩定的雜交復合體。這一原理對于檢測一個(gè)特異的mRNA在某一種生物體，或者某些組織切片、單個(gè)細胞里具體表達位置非常有用。該技術(shù)最早應用于60年代末期，由于核酸分子雜交的特異性高，并可精確定位，因此該技術(shù)已被廣泛應用，例如與細胞內RNA進(jìn)行雜交以觀(guān)察該組織細胞中特定基因表達水平。原位雜交能在成分復雜的組織中進(jìn)行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對于那些細胞數量少且散在于其他組織中的細胞內DNA或RNA研究更為方便；同時(shí)由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)，更能準確地反映出組織細胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。
核酸原位雜交可根據其檢測物而分為細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交；根據其所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經(jīng)過(guò)組織細胞的固定，預雜交，雜交，沖等一系列洗步驟及放射自顯影或免疫酶法顯色以顯示雜交結果。
我們在這兒介紹的是整胚原位雜交，不同于一般的在載片上對細胞和組織切片進(jìn)行探針雜交及檢測的原位雜交，而是對完整的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行探針雜交及檢測，從整體上把握探針的結合部位，然后對胚胎進(jìn)行切片，以確定探針結合的具體位置。整胚原位雜交在斑馬魚(yú)分子生物學(xué)研究中是一種非常重要的實(shí)驗方法，原位雜交的探針可以是同位素的探針，用放射自顯影來(lái)檢測；也可以是非同位素的探針，通過(guò)熒光或酶法予以檢測。我們這兒所介紹的一種原位雜交的方法是通過(guò)后者，以地高辛標記探針，然后用酶聯(lián)抗體的方法進(jìn)行檢測。
原位雜交（In situ hybridazation）
固定
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C 保存，待用（兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成）
6.RNA熒光原位雜交
原位雜交：在研究DNA分子復制原理的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)。
其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過(guò)氫鍵結合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點(diǎn)，應帶有標記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DAN或 RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內待測核酸。（RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀(guān)察目的 mRNA或DAN 的存在與定位；用原位雜交術(shù)，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。
此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水來(lái)探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)。
