制作平板培養基的(配制培養基應注意哪些問(wèn)題)
1.配制培養基應注意哪些問(wèn)題
1、培養基配方的選定
同一種培養基的配方在不同著(zhù)作中常會(huì )有某些差別。因此，除所用的是標準方法，應嚴格按其規定進(jìn)行配制外，一般均應盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據自己的使用目的，加以選用，記錄其來(lái)源。
2、培養基的制備記錄
每次制備培養基均應有記錄，包括培養基名稱(chēng)，配方及其來(lái)源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等，記錄應復制一份，原記錄保存備查，復制記錄隨制好的培養基一同存放、以防發(fā)生混亂。
3、培養基成分的稱(chēng)取
培養基的各種成分必須精確稱(chēng)取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷。可將配方置于傍側，每稱(chēng)完一種成分即在配方面軍做出記號，并將所需稱(chēng)取的藥品一次取齊，置于左側，每種稱(chēng)取完畢后，即移放于右側。完全稱(chēng)取完畢后，還應進(jìn)行一次檢查。
4、培養基各成份的混合和溶化
培養基所用化學(xué)藥品均應是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養基中，使細菌不易生長(cháng)。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水加熱并隨時(shí)擾動(dòng)、以防焦化、如發(fā)現有焦化現象、該培養基即不能使用，應重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過(guò)程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補足。
5、培養基pH的初步調正
因培養基在加熱消毒過(guò)程中、pH會(huì )有所變化，培養基各成分完全溶解后，應進(jìn)行PH的初步調正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會(huì )有顯著(zhù)的升高。因此，對這個(gè)步驟，操作者應隨時(shí)注意探索經(jīng)驗、以期能掌握培養基的最終PH，保證培養基的質(zhì)量。PH調整后，還應將培養基煮沸數分鐘，以利培養基沉淀物的析出。
6、培養基的過(guò)濾澄清
液體培養基必須絕對澄清，瓊脂培養基也應透明無(wú)顯著(zhù)沉淀，因此 ，須要采用過(guò)濾或其它澄清方法以達到此項要求。一般液體培養基可用濾紙過(guò)濾法，濾紙應折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。
瓊脂培養基可用清潔的白色薄絨布趁熱過(guò)濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過(guò)濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復過(guò)濾。如過(guò)濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55~60°C的培養基放入大的三角燒瓶?jì)龋b入量不得超過(guò)燒瓶容量的1/2，每1000ml培養基加入1~2個(gè)雞蛋的蛋白，強力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121°C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過(guò)濾即可。
7、培養基的分裝
培養基的分裝，應按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當容器內。分裝量不得超過(guò)容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養基時(shí)，分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當。分裝容器應預先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養基的徹底滅菌。每批培養基應另外分裝20ml培養基于一小玻璃瓶中，隨該批培養基同時(shí)滅菌，以為測定該批培養基最終pH之用。
8、培養基的滅菌
一般培養基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養基制備方法中，如無(wú)特殊規定，即可用此法滅菌。
某些畏熱成分，如糖類(lèi)，應另行配成20%或更高的濃液，以過(guò)濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無(wú)菌操作技術(shù)、定量加于培養基。明膠培養基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無(wú)菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50°C左右的培養基中。
瓊脂斜面培養基應在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時(shí)，擺置成適當斜面，待其自然凝固。
9、培養基的質(zhì)量測試
每批培養基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發(fā)現破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。
將全部培養基放入36±1°C恒溫箱培養過(guò)夜，如發(fā)現有菌生長(cháng)，即棄去。
用有關(guān)的標準菌株接種1~2管或瓶培養基，培養24~48小時(shí)，如無(wú)菌生長(cháng)或生長(cháng)不好。應追查原因并重復接種一次，如結果仍同前，則該批培養基即應棄去，不能使用。
10、培養基的保存
培養基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內。放置時(shí)間不宜超過(guò)一周，傾注的平板培養基不宜超過(guò)3天。每批培養基均必須附有該批培養基制備記錄副頁(yè)或明顯標簽。
2.培養基的制作及無(wú)菌操作技術(shù)常見(jiàn)的注意事項
培養基的制作注意事項：
1 注意營(yíng)養物質(zhì)的濃度比和C/N比
2 控制pH條件
3 原料來(lái)源的選擇
4 滅菌處理
無(wú)菌操作注意事項：
1. 實(shí)驗進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %
ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺風(fēng)扇運轉10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗操作。每
次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間
污染。實(shí)驗完畢后，將實(shí)驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間
隔應讓無(wú)菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細胞株之操作。
2. 無(wú)菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗用品以70 % ethanol 擦
拭后才帶入無(wú)菌操作臺內。實(shí)驗操作應在抬面之中央無(wú)菌區域，勿在邊緣之非無(wú)菌區域操
作。
3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，
盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗。對于來(lái)自人類(lèi)或是病毒
感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無(wú)菌操作臺（至少Class II）。操作過(guò)程
中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳
針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染（水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換）。
5.3. 無(wú)菌操作臺內之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線(xiàn)燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預濾網(wǎng)（300
小時(shí)/預濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水
3.配置培養基的基本步驟有哪些
培養基的配置應該注意的幾大步驟：1、常用玻璃儀器的準備制備培養基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。
（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用。 （2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用。
（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。其他玻璃器皿均應按上法處理，也應裝金屬筒內160℃干熱滅菌2h后，備用。
2、培養基的制備及儲存 （1）溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷齊內。加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應經(jīng)常攪拌，防止焦結，待其溶解后補足水分。
在使用干燥培養基時(shí)，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱(chēng)取一定量培養基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長(cháng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，溫度不宜過(guò)高，避免某些營(yíng)養成分被破壞。 （2）校正酸堿度（調節pH）：培養基必須有適當的pH。
因此測定pH是培養基配制過(guò)程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃。調節pH可用無(wú)菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。
當調節緩沖液的pH時(shí)，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。滅菌后的pH會(huì )比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養基的pH會(huì )比最終pH調高0.2左右，滅菌后基本合適。
因此對培養基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測定，并記下每次pH的測定結果，有助于積累數據考察每種培養基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導滅菌前pH的調節。干燥培養基一般已校正過(guò)pH，用時(shí)也必須再驗證。
測定時(shí)，一般用指示劑滴入培養基觀(guān)察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調整pH后要加熱過(guò)濾，使培養基澄清。
（ 更多質(zhì)量檢測、分析測試、化學(xué)計量、標準物質(zhì)相關(guān)技術(shù)資料請參考中國標準物質(zhì) ） (3)培養基的分裝：大批量配制時(shí)使用的自動(dòng)分配器須經(jīng)校準和確認。每次使用前后，均要對分配器的管道系統進(jìn)行沖洗，在分裝無(wú)菌培養基前，則要采用無(wú)菌硅膠管。
固體培養基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據需要分裝平皿或試管。 平皿：傾注平皿，應在無(wú)菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養箱 中倒置30—60min。
讓水蒸汽自然蒸發(fā)。 斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養基，如沾有培養基應用布抹去，以避免污染。
高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用。 分裝好的培養基或緩沖液等及時(shí)密封后必須在配制當天（2h內最佳）進(jìn)行滅菌處理。
液體、半固體培養基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。 培養基的滅菌：培養基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定。
普通培養基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時(shí)，應延長(cháng)至20min。含糖培養基115℃、68.85kPa滅菌30min。
含糖、血清、雞蛋等培養基可用流動(dòng)蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續3d，間歇滅菌。血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細菌過(guò)濾器，過(guò)濾除菌。
高壓滅菌應嚴格按照操作規程執行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內的空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時(shí)間，達到全部殺滅微生物。以上的滅菌時(shí)間和溫度要經(jīng)過(guò)驗證確認，如不同類(lèi)型培養基混合一起滅菌時(shí)宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好。
通過(guò)無(wú)菌技術(shù)為測試制備的每一批培養基其PH在放冷至室溫（25°）后，都應測定。一個(gè)扁平的pH計用于培養基表面pH值的測定，浸入式的pH計用于液體的測定。
各供應商提供的培養基的pH應該在規定的±0.2的范圍內，除非通過(guò)驗證得到更寬的范圍 注意：按配方計算培養基中各種成分的用量→稱(chēng)量，（一般動(dòng)作要迅速一些，因為其中可能有些成分容易吸潮）→溶化（將稱(chēng)好的各種成分溶解在水中，如果是固體培養基，需要使用凝固劑，如瓊脂等，熔化時(shí)，注意攪拌，防止糊底）→調pH→滅菌（高壓蒸汽滅菌）→倒平板 1）確認培養基的成分，并精確稱(chēng)量；2）加入各個(gè)成分的順序；3）準確調pH;4） 適當的滅菌方法；5）無(wú)菌條件下分裝.。
