植物rna反轉錄合成cdna(反轉錄酶的注意事項)
1.反轉錄酶的注意事項有哪些?
反轉錄酶在進(jìn)行RT反應之前，應考慮以下幾個(gè)方面：1、RNA成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA，高質(zhì)量的RNA至少應保證全長(cháng)并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。
在提取RNA的過(guò)程中，要特別防止RNase的污染，同時(shí)在逆轉錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長(cháng)度和產(chǎn)量。 RNase抑制劑要在第一鏈cDNA合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過(guò)程會(huì )使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。
蛋白RNase抑制劑僅防止RNaseA,B,C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實(shí)驗過(guò)程中經(jīng)常更換新手套。 2、引物的選擇OligodT選擇OligodT時(shí)，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。
適合長(cháng)鏈甚至全長(cháng)mRNA的RT，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，最好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應，建議推薦使用OligodT引物。
使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。隨機引物適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達量很低）。
選擇隨機引物時(shí)，第一鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應時(shí)設計引物進(jìn)行特異性擴增。 同時(shí)要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì )導致小片段產(chǎn)物（。
2.RNA是如何反轉錄成cDNA的
操作步驟是先加RNA、OligodT、隨即引物、水
65C反應10min，冰上放置5min后：這一步是讓RNA變性，把RNA的二級結構打開(kāi)；
再加dNTP,RNaseA,BUFFER,
MTV逆轉錄酶，
反應25℃10min：這一步是讓反轉錄引物（oligodT，隨機引物）和模板RNA退火結合
37℃60min：這一步是反轉錄酶的工作溫度
70℃10min：這一步是變性，把合成的cDNA和RNA變性開(kāi)，就拿到單鏈的cDNA
3.反轉錄的cdna電泳應該是怎樣的
RNA反轉錄的cDNA是單鏈的還是雙鏈的
是單鏈cDNA，想合成雙鏈cDNA需要另外操作：
一、cDNA第二鏈的合成：
1. 第一鏈反應完成后，取2ul一鏈產(chǎn)物-20℃冰箱中保存，待電泳檢測。其余的產(chǎn)物合并，混勻，然后順序加入下列試劑（promega）:
20ul 10*DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP（自己配制）
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
總體系為200ul;
2. 混勻后，16℃反應2.5小時(shí)；
3. 70℃滅活10分鐘；
4. 反應完成后，得到200ul cDNA第二鏈反應體系，將此體系置于冰上；
5.取2ul二鏈產(chǎn)物，同保存的一鏈產(chǎn)物一起電泳鑒定。同時(shí)上1kb ladder，確定雙鏈的大小范圍。
注：一鏈，二鏈的電泳圖是smear，且二鏈稍比一鏈大一些。
