植物rna反轉(zhuǎn)錄合成cdna(反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項)

1.反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項有哪些?

反轉(zhuǎn)錄酶在進行RT反應(yīng)之前，應(yīng)考慮以下幾個方面：1、RNA成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA，高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。

在提取RNA的過程中，要特別防止RNase的污染，同時在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。 RNase抑制劑要在第一鏈cDNA合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。

蛋白RNase抑制劑僅防止RNaseA,B,C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實驗過程中經(jīng)常更換新手套。 2、引物的選擇OligodT選擇OligodT時，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。

適合長鏈甚至全長mRNA的RT，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，最好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用OligodT引物。

使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。隨機引物適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。

選擇隨機引物時，第一鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。 同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（。

2.RNA是如何反轉(zhuǎn)錄成cDNA的

操作步驟是先加RNA、OligodT、隨即引物、水

65C反應(yīng)10min，冰上放置5min后：這一步是讓RNA變性，把RNA的二級結(jié)構(gòu)打開；

再加dNTP,RNaseA,BUFFER,

MTV逆轉(zhuǎn)錄酶，

反應(yīng)25℃10min：這一步是讓反轉(zhuǎn)錄引物（oligodT，隨機引物）和模板RNA退火結(jié)合

37℃60min：這一步是反轉(zhuǎn)錄酶的工作溫度

70℃10min：這一步是變性，把合成的cDNA和RNA變性開，就拿到單鏈的cDNA

3.反轉(zhuǎn)錄的cdna電泳應(yīng)該是怎樣的

RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA是單鏈的還是雙鏈的

是單鏈cDNA，想合成雙鏈cDNA需要另外操作：

一、cDNA第二鏈的合成：

1. 第一鏈反應(yīng)完成后，取2ul一鏈產(chǎn)物-20℃冰箱中保存，待電泳檢測。其余的產(chǎn)物合并，混勻，然后順序加入下列試劑（promega）:

20ul 10*DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP（自己配制）

xul dd H2O

1ul RNase H(2U/ul)

10ul DNA Polymerase I(10U/ul)

總體系為200ul;

2. 混勻后，16℃反應(yīng)2.5小時；

3. 70℃滅活10分鐘；

4. 反應(yīng)完成后，得到200ul cDNA第二鏈反應(yīng)體系，將此體系置于冰上；

5.取2ul二鏈產(chǎn)物，同保存的一鏈產(chǎn)物一起電泳鑒定。同時上1kb ladder，確定雙鏈的大小范圍。

注：一鏈，二鏈的電泳圖是smear，且二鏈稍比一鏈大一些。