elisa血清稀釋(ELISA實(shí)驗(yàn)的操作注意事項(xiàng)有哪些)
1.ELISA實(shí)驗(yàn)的操作注意事項(xiàng)有哪些
1.儲(chǔ)存.
收到試劑盒后應(yīng)盡快放入冷藏室內(nèi)保存，保存溫度為4℃-8℃.
2.回溫.
試劑盒在使用前應(yīng)于室溫（22-27℃）下充分回溫，回溫時(shí)間為40-60分鐘.回溫過(guò)程中勿將酶標(biāo)板的包裝袋開(kāi)封，回溫結(jié)束后再將其從包裝袋中取出使用.
3.樣品稀釋.
樣品稀釋?xiě)?yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋.如稀釋倍數(shù)過(guò)大，可采用多步法進(jìn)行樣品稀釋.例如：試劑盒要求樣品需進(jìn)行500倍稀釋，可吸取5μl樣品加入245μl樣品稀釋液中，充分混勻后，再吸取10μl混合液加入90μl樣品稀釋液中即可.
4.加樣.
稀釋好的樣品在加入酶標(biāo)板進(jìn)行孵育的過(guò)程中，盡可能縮短第一次加樣和最后一次加樣的時(shí)間間隔，樣品加好后馬上開(kāi)始計(jì)時(shí).
5.洗板.
樣品孵育時(shí)間結(jié)束后，馬上甩去孔內(nèi)液體.如多塊酶標(biāo)板需同時(shí)洗滌，可先將板內(nèi)液體甩去，倒扣于吸水紙上，再依次進(jìn)行洗滌.使用洗板機(jī)洗滌時(shí)，建議洗滌次數(shù)增加一次.未用完的洗滌液可在4℃-8℃下密封保存1月.
6.顯色.
底物藥片可在顯色前3-5分鐘加入底物緩沖液中，混合直到完全溶解.本試劑最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周.
7.終止及讀數(shù).
提前打開(kāi)酶標(biāo)儀，加入終止液后立即讀數(shù).
8.同批號(hào)試劑盒中的試劑，除酶標(biāo)二抗及陽(yáng)性對(duì)照外，其余均可通用.
9.移液器的正確使用、保存、清潔、校對(duì).
10.實(shí)驗(yàn)室管理
桌面保持整潔，插槍頭戴手套等.
2.ELISA 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)知多少
？?jī)?yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。
ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)一般均用板式。本文將敘述板式ELISA各個(gè)操作步驟的注意要點(diǎn)（珠式、管式及磁性球ELSIA，國(guó)外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細(xì)的使用說(shuō)明，須嚴(yán)格遵照規(guī)程操作）。
標(biāo)本的采取和保存 通常我們可用于ELISA檢測(cè)的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測(cè)樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測(cè)的正確性和準(zhǔn)確性的第一步，下面簡(jiǎn)單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。
血清 血清是最常用于ELISA檢測(cè)的一類樣本，處理也比較簡(jiǎn)單。 用無(wú)熱原、無(wú)內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標(biāo)本，將試管或離心管室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，使血清析出。
（最好將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃1000*g離心20min，仔細(xì)收集上清。
建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。 采血過(guò)程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)釋放具有過(guò)氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標(biāo)記的ELISA檢測(cè)中會(huì)有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測(cè)的不準(zhǔn)確性。
同時(shí)也應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榫w內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性。 血漿 用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本，標(biāo)本采集后30min內(nèi)4℃1000*g離心15min，取上清即血漿。
將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標(biāo)本。
常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測(cè)時(shí)還應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢查試劑盒是否對(duì)抗凝劑有特殊要求。 細(xì)胞培養(yǎng)上清 取細(xì)胞培養(yǎng)上清到離心管，1000*g離心20min，除去細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
細(xì)胞裂解液 1） 吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞，加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來(lái)。懸浮細(xì)胞可省略。
2） 收集細(xì)胞懸液，1000*g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次。 3） 加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。
通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸。 4） 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞充分裂解。
也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。 5) 4℃10000*g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
組織勻漿液 1） 將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。 2） 將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充分。
3） 將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時(shí)置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，檢測(cè)后計(jì)算樣品濃度時(shí)應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)）。
4） 吸取勻漿液到離心管，4℃5000*g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。 尿液、唾液等其他液體生物樣本 1000*g離心20min，取上清即可檢測(cè)。
總的來(lái)說(shuō)，因?yàn)镋LISA只能檢測(cè)可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。 為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，保存于-20℃或-80℃的樣本最好在1~6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)；4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
另外，還應(yīng)保證樣本不含NaN3，因?yàn)镹aN3會(huì)抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。 試劑的準(zhǔn)備 按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。
ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液、洗滌液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量。
從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用，一般室溫平衡不低于30min。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。
加樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣（一般不建議使用）。
有些指標(biāo)檢測(cè)（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1min。
加酶結(jié)合物工作液和底物工作液時(shí)可用多道移液器，使加液過(guò)程在最短時(shí)間內(nèi)完成。 保溫 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。
抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育。 ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。
以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需。
3.怎樣正確溶解與稀釋ELISA標(biāo)準(zhǔn)品
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計(jì)算的尺子，標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA 實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。怎樣正確溶解、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品呢？
1. 粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心，讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。
2. 根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水，加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置溶解 10-30min，讓粉末完全溶解。
注意：加水后暫不用移液槍吹吸，避免蛋白未溶解，槍頭帶出部分蛋白，待完全溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：
(1)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的選擇：
若血清、血漿、組織勻漿樣本，用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
若細(xì)胞上清樣本，建議用細(xì)胞培養(yǎng)基梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
(2)耗材準(zhǔn)備：準(zhǔn)備8個(gè)1.5Ml離心管，寫(xiě)上S1-S7、空白。
(3)梯度稀釋：根據(jù)說(shuō)明書(shū)，每管加入等體積的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（培養(yǎng)基）。吸取同體積溶解好的標(biāo)準(zhǔn)品到S1管中，吹打10次混勻，渦旋5S。從S1管中吸取同體積溶液到 S2管，吹打10次混勻，渦旋5s。同法稀釋S3-S7濃度。
(4)空白： 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（培養(yǎng)基）作為空白即零濃度。
注意：梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，渦旋震蕩混勻后可短暫離心，讓到蓋子、壁上的液體到管底，再開(kāi)始稀釋下個(gè)濃度。
標(biāo)準(zhǔn)品溶解、梯度稀釋是ELISA實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)，按以上方法梯度稀釋即可。
4.elisa 實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中有哪些注意事項(xiàng)
注意事項(xiàng)：
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（*n*5）。
5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6.底物請(qǐng)避光保存。
7.嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9.不同批號(hào)組分不得混用。
5.做elisa實(shí)驗(yàn)需要注意哪些問(wèn)題?
Elisa實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題，包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問(wèn)題，希望對(duì)你有用處。
Elisa試劑盒有著準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)的諸多優(yōu)點(diǎn)，深受廣大用戶朋友的喜愛(ài)。然而，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，也需要注意很多問(wèn)題。對(duì)此，武漢福來(lái)生物工程提醒你，需要遵守一些規(guī)則，才能更好地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取得較好的實(shí)驗(yàn)成果。
Elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。在Elisa測(cè)定中影響因素較多，在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)常見(jiàn)到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：標(biāo)本因素；試劑因素；操作因素。
1.樣品稀釋
一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過(guò)大量試驗(yàn)確定，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。
2.試劑盒平衡
Elisa中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20~30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3.樣品和試劑的混勻
在稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性。
4.加樣
加樣是一項(xiàng)很重要的步驟。加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。
5.溫育
溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。
6.洗板
固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái)，以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時(shí)更換吸水紙，尤其是拍過(guò)酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。
7.顯色
顯色一定要控制時(shí)間，根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作即可。一般來(lái)說(shuō)，顯色時(shí)間過(guò)短，結(jié)果偏低；顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，空白增高或者非特異性顯色增加。
8.比色
比色要注意波長(zhǎng)的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。
6.ELISA實(shí)驗(yàn)操作中注意事項(xiàng)有哪些啊
1.儲(chǔ)存。
收到試劑盒后應(yīng)盡快放入冷藏室內(nèi)保存，保存溫度為4℃-8℃。2.回溫。
試劑盒在使用前應(yīng)于室溫（22-27℃）下充分回溫，回溫時(shí)間為40-60分鐘?；販剡^(guò)程中勿將酶標(biāo)板的包裝袋開(kāi)封，回溫結(jié)束后再將其從包裝袋中取出使用。
3.樣品稀釋。樣品稀釋?xiě)?yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋。
如稀釋倍數(shù)過(guò)大，可采用多步法進(jìn)行樣品稀釋。例如：試劑盒要求樣品需進(jìn)行500倍稀釋，可吸取5μl樣品加入245μl樣品稀釋液中，充分混勻后，再吸取10μl混合液加入90μl樣品稀釋液中即可。
4.加樣。稀釋好的樣品在加入酶標(biāo)板進(jìn)行孵育的過(guò)程中，盡可能縮短第一次加樣和最后一次加樣的時(shí)間間隔，樣品加好后馬上開(kāi)始計(jì)時(shí)。
5.洗板。樣品孵育時(shí)間結(jié)束后，馬上甩去孔內(nèi)液體。
如多塊酶標(biāo)板需同時(shí)洗滌，可先將板內(nèi)液體甩去，倒扣于吸水紙上，再依次進(jìn)行洗滌。使用洗板機(jī)洗滌時(shí)，建議洗滌次數(shù)增加一次。
未用完的洗滌液可在4℃-8℃下密封保存1月。6.顯色。
底物藥片可在顯色前3-5分鐘加入底物緩沖液中，混合直到完全溶解。本試劑最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周。
7.終止及讀數(shù)。提前打開(kāi)酶標(biāo)儀，加入終止液后立即讀數(shù)。
8.同批號(hào)試劑盒中的試劑，除酶標(biāo)二抗及陽(yáng)性對(duì)照外，其余均可通用。9.移液器的正確使用、保存、清潔、校對(duì)。
10.實(shí)驗(yàn)室管理 桌面保持整潔，插槍頭戴手套等。
